badanie aktywności kompleksowej olejków eterycznych Anti-Burkholderia cepacia: wstępna analiza

Streszczenie

w tej pracy sprawdziliśmy zdolność olejków eterycznych ekstrahowanych z sześciu różnych roślin leczniczych (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula officinalis, Melaleuca alternifolia i Thymus vulgaris) do hamowania wzrostu 18 szczepów typu bakteryjnego należących do 18 znanych gatunków Burkholderia cepacia Complex (BCC). Bakterie te są oportunistycznymi ludzkimi patogenami, które mogą powodować ciężkie zakażenia u pacjentów z obniżoną odpornością, zwłaszcza u pacjentów z mukowiscydozą (mukowiscydoza) i często są oporne na wiele antybiotyków. Analiza aromatogramów wytwarzanych przez sześć olejów wykazała, że pomimo odmiennego składu chemicznego wszystkie z nich były w stanie przeciwstawić wzrostowi członków Bcc. Jednak trzy z nich (tj., Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare i Thymus vulgaris) były szczególnie aktywne w porównaniu ze szczepami Bcc, w tym wykazującymi wysoki stopień lub oporność na cyprofloksacynę, jeden z najczęściej stosowanych antybiotyków w leczeniu zakażeń Bcc. Te trzy oleje są również aktywne zarówno w odniesieniu do szczepów środowiskowych, jak i klinicznych (wyizolowanych od pacjentów z mukowiscydozą), co sugeruje, że mogą być stosowane w przyszłości do zwalczania zakażeń kompleksu B. cepacia.

1. Wprowadzenie

olejki eteryczne (EOs) składają się ze złożonej mieszanki substancji lotnych i zapachowych, Zwykle syntetyzowanych przez wszystkie narządy roślin jako metabolity wtórne i ekstrahowanych przez destylację wodą lub parą wodną, ekstrakcję rozpuszczalnikiem, ekspresję pod ciśnieniem, płyn nadkrytyczny i subkrytyczną ekstrakcję wody . EOs obejmują dwie powiązane biosyntetycznie grupy, głównie terpeny i terpenoidy oraz, wtórnie, składniki aromatyczne i alifatyczne, wszystkie charakteryzujące się niską masą cząsteczkową. Właściwości biologiczne terpenoidów EOs nie są dobrze wyjaśnione, ale postuluje się funkcję ochrony roślin przed drapieżnikami i drobnoustrojami chorobotwórczymi i mogą być ważne w interakcji roślin z innymi organizmami (np. przyciąganie zapylaczy). Te same gatunki roślin mogą wytwarzać różne chemotypy EOs (tj. składniki chemiczne). Na przykład grasica pospolita, morfologicznie identyczny gatunek o stabilnym kariotypie, składa się z siedmiu różnych chemotypów w zależności od tego, czy dominującym składnikiem olejku eterycznego jest tymol, karwakrol, linalol, geraniol, uwodniony sabinen, α-terpineol lub eukaliptol.

w ostatnich latach pojawienie się oporności bakterii na wiele antybiotyków znacznie przyspieszyło. Chinolony / fluorochinolony, azole i polienowe klasy środków przeciwdrobnoustrojowych często są ostatecznością w leczeniu zakażeń; stąd szanse na uzyskanie oporności na te środki przeciwdrobnoustrojowe są wyższe . EOs i inne ekstrakty roślinne mają właściwości przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze i przeciwwirusowe i zostały przebadane na całym świecie jako potencjalne źródła nowych związków przeciwdrobnoustrojowych . Tak więc EOs i ich składniki mogą być, miejmy nadzieję, rozważone w przyszłości w celu przeprowadzenia większej oceny klinicznej i możliwych zastosowań oraz jako adiuwanty do obecnych leków . Właściwości przeciwbakteryjne EOs opisano w kilku badaniach. Wysoka aktywność przeciwbakteryjna gatunków grasicy i Origanum została przypisana ich składnikom fenolowym, takim jak tymol i karwakrol, a Eugenia caryophyllus, Syzygium aromaticum i Ocimum basilicum eugenolowi . W rzeczywistości tymianek i oregano EOs mogą hamować niektóre patogenne szczepy bakterii, takie jak Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis i Salmonella typhimurium, z hamowaniem bezpośrednio skorelowanym z karwakrolem i tymolem . Mechanizmy, dzięki którym olejki eteryczne mogą hamować mikroorganizmy, obejmują różne tryby działania i częściowo mogą być spowodowane ich hydrofobowością. W rezultacie dostają się one do dwuwarstwy lipidowej błony komórkowej, czyniąc ją bardziej przepuszczalną, prowadząc do wycieku zawartości życiowych komórek . Istnieje mniej doniesień na temat mechanizmów działania kombinacji EOs lub ich oczyszczonych składników na mikroorganizmy. Obejmują one sekwencyjne hamowanie wspólnego szlaku biochemicznego, hamowanie enzymów ochronnych i stosowanie środków aktywnych ściany komórkowej w celu zwiększenia wychwytu innych środków przeciwdrobnoustrojowych. Zdolność węglowodorów do interakcji z błoną komórkową ułatwia przenikanie karwakrolu do komórki. W wielu przypadkach aktywność wynika ze złożonych interakcji między różnymi klasami związków, takich jak fenole, aldehydy, ketony, alkohole, estry, etery lub węglowodory występujące w EOs . Jest prawdopodobne, że bakteriom trudniej będzie rozwinąć oporność na wieloskładnikowe EOs niż na zwykłe antybiotyki, które często składają się tylko z jednej jednostki molekularnej . Na przykład wieloskładnikowy charakter olejku z drzewa herbacianego może zmniejszyć możliwość wystąpienia spontanicznej oporności, ponieważ może być konieczne wielokrotne jednoczesne mutacje w celu przezwyciężenia wszystkich działań przeciwbakteryjnych każdego ze składników. Oznacza to, że wiele celów musiałoby się dostosować, aby przezwyciężyć skutki ropy naftowej .

badania kliniczne z EOs są rzadkie. Stosowanie miejscowe jest obecnie najbardziej obiecującą strategią, zarówno dla skóry, jak i błon śluzowych. Istnieje pewna nadzieja na zastosowania inhalacyjne, ale potrzebna jest ocena kliniczna. Istnieje niewiele informacji dotyczących bezpieczeństwa w odniesieniu do doustnego podawania produktu EOs, dlatego konieczne jest zwiększenie wiedzy na temat farmakokinetyki, farmakodynamiki i potencjalnej toksyczności produktu EOS podawanego tą drogą.

szczególnie interesująca z tego punktu widzenia jest możliwość leczenia zakażeń chorych na mukowiscydozę (mukowiscydozę). Jednym z najważniejszych patogenów oportunistycznych CF są bakterie należące do kompleksu Burkholderia cepacia (BCC)należącego do bardzo heterogenicznego rodzaju Burkholderia, który obecnie obejmuje ponad siedemdziesiąt gatunków, izolowanych z wielu nisz. Wielu członków rodzaju może powodować infekcje u roślin, zwierząt i ludzi, a większość badań koncentrowała się na tych patogennych gatunkach ze względu na ich znaczenie kliniczne . Jednak ostatnio opisano coraz większą liczbę gatunków Burkholderia związanych z roślinami lub środowiskiem i zdolnych do wiązania azotu, nodulowania roślin strączkowych lub wspierania wzrostu roślin . Wśród gatunków patogennych bakterie Bcc, Grupa genetycznie różnych, ale fenotypowo podobnych bakterii, które do tej pory obejmują 18 blisko spokrewnionych gatunków bakterii, stały się znane jako patogeny oportunistyczne u ludzi. Chociaż nie są one uważane za ważne czynniki chorobotwórcze dla normalnej populacji ludzkiej, niektóre z nich są uważane za poważne zagrożenie dla określonych grup pacjentów, takich jak pacjenci z mukowiscydozą . CF jest najbardziej śmiertelną chorobą genetyczną rasy kaukaskiej, a główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów jest przewlekłe zakażenie płuc z udziałem różnych gatunków bakterii (głównie Pseudomonas aeruginosa), grzybów i wirusów . Jeśli chodzi o gatunki Bcc, częstość występowania (2009 i 2010) przewlekłego zakażenia waha się od 0 do 12% populacji chorych na mukowiscydozę uczęszczających do różnych ośrodków mukowiscydozy . Chociaż nie jest wysoki w porównaniu z innymi patogenami mukowiscydozy, zakażenia Bcc korelują z gorszym rokowaniem, dłuższymi pobytami w szpitalu i zwiększonym ryzykiem zgonu .

jedną z przyczyn wysokiego wskaźnika śmiertelności w zakażeniach wywołanych przez Gatunki Bcc jest ich wysoka odporność na antybiotyki: są one wewnętrznie odporne na wiele antybiotyków i mogą rozwijać oporność in vivo na zasadniczo wszystkie klasy leków przeciwdrobnoustrojowych . Ta wysoka oporność na antybiotyki jest wynikiem mechanizmów specyficznych dla niektórych klas antybiotyków i swoistej oporności, charakterystycznej dla wszystkich bakterii Gram-ujemnych, ze względu na współpracę między zewnętrzną barierą membranową a ekspresją systemów wypływowych . W układach wielolekowych oporność bakterii Gram-ujemnych na lek wynika głównie z rodziny białek typu RND (resistance-nodulation-cell division protein family). Obecność i rozmieszczenie tych rodzajów białek w niektórych dostępnych genomach Burkholderia są znane, a niektóre z tych systemów również zostały eksperymentalnie scharakteryzowane .

nowe środki przeciwdrobnoustrojowe są zawsze potrzebne, aby przeciwdziałać mutantom opornym na Bcc, które nadal są wybierane przez obecne schematy terapeutyczne. Oporność bakterii często skutkuje niepowodzeniem leczenia, co powoduje poważne następstwa, zwłaszcza u pacjentów w stanie krytycznym . Nieodpowiednie lub niepotrzebne recepty na antybiotyki, nadmierne stosowanie antybiotyków w przemyśle rolnym i hodowlanym oraz brak przestrzegania przez pacjentów pełnych schematów antybiotykowych, z których wszystkie wybierają oporne bakterie, wydają się być kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do powstania oporności na antybiotyki. Oporne bakterie mogą również rozprzestrzeniać się i stawać się szerszymi problemami z kontrolą infekcji, nie tylko w instytucjach opieki zdrowotnej,ale także w społecznościach. Z tego powodu istnieje pilna potrzeba opracowania nowych terapii przeciwbakteryjnych nie tylko przeciwko bakteriom Bcc, ale także przeciwko innym różnym ludzkim patogenom . W tym kontekście jednym z najważniejszych podejść jest poszukiwanie nowych naturalnych leków z “niezwykłych” źródeł; szczególnie interesujące mogą być olejki eteryczne, ponieważ są one wieloskładnikowe i zasadniczo prawdopodobieństwo rozwoju odporności bakterii na tę mieszaninę substancji może być znacznie mniejsze niż na jedną cząsteczkę.

w związku z tym celem niniejszej pracy było zbadanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej sześciu różnych olejków eterycznych w porównaniu z panelem bakterii Bcc, z których niektóre wykazują multiresistance na różne leki i ze źródłem klinicznym lub środowiskowym, w celu sprawdzenia możliwości stosowania olejków eterycznych do zwalczania zakażeń Bcc u pacjentów z mukowiscydozą.

2. Materiały i metody

2.1. Szczepy bakterii i warunki wzrostu

szczepy bakterii użyte w tej pracy są wymienione w tabeli 1. Uprawiano je na Tryptonowym agarze sojowym (TSA, Oxoid S. p. A.)., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Włochy) pożywka w temperaturze 37°C przez dwa dni lub w ciekłym bulionie sojowym Tryptonowym (TSB, Oxoid S. p. A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Włochy) pożywka w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.

Burkholderia cepacia complex strains
Strain Origin Species Sensitivity to
Eugenia caryophyllata Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Lavandula hybrida Melaleuca alternifolia Thymus vulgaris Ciprofloxacin
LMG 13010 CF B. multivorans ES ES S S S ES VS
J2315 CF B. cenocepacia ES ES S S S ES S
LMG 14294 CF B. stabilis ES ES S S S ES NS
LMG 24064 CF B. latens ES ES ES S S ES ES
LMG 24065 CF B. diffusa ES ES VS S S ES VS
LMG 18943 CF B. dolosa ES ES VS S VS ES NS
LMG 24067 CF B. seminalis ES ES S S S ES VS
LMG 24068 CF B. metallica ES ES S S S ES ES
LMG 26883 CF B. pseudomultivorans ES ES VS S S ES VS
LMG 23361 AI B. contaminas ES ES VS S S ES ES
LMG 1222 Env B. cepacia VS ES S S S ES VS
LMG 10929 Env B. vietnamiensis ES ES ES S VS ES ES
LMG 19182 Env B. ambifaria ES ES NS S S ES ES
LMG 20980 Env B. anthina ES ES VS S ES ES ES
LMG 14191 Env B. pyrrocinia ES ES VS S ES ES ES
LMG 22485 Env B. lata ES ES S S S ES ES
LMG 24066 Env B. arboris ES ES VS S S ES ES
LMG 20358 Env B. ubonensis ES ES ES S VS ES ES
CF: strain isolated from cystic fibrosis patient; Env: environmental strain; AI: animal infection; NS, S, VS, and ES: niezbyt wrażliwe, wrażliwe, bardzo wrażliwe i niezwykle wrażliwe, odpowiednio (według Ponce et al., 2003) .
Tabela 1
lista szczepów bakterii użytych w pracy i ich wrażliwości na olejki eteryczne badane w pracy.

2.2. Aromatogramy
2.2.1. Przygotowanie zawiesin drobnoustrojów i pożywek

każdy szczep bakterii uprawiano w temperaturze 37°C w ciekłym podłożu (TSB) z wytrząsaniem; wzrost był sprawdzany w regularnych odstępach czasu (jako odczyt spektrofotometryczny w OD600) do końca fazy wykładniczej wzrostu. Seryjne rozcieńczenia 1 : 10 do 10-5 każdej zawiesiny bakteryjnej nakładano na płytki Petriego TSA w celu policzenia mikroorganizmów i sprawdzenia, czy liczba bakterii w próbkach była odpowiednia do wykonania testów.

TSA, używany do wykonywania testów dyfuzji agarów, został wzbogacony odpowiednią objętością dimetylosulfotlenku (DMSO, Carlo Erba Reagenti S. p. A., Strada Rivoltana km 6/7, 20090 Rodano, MI, Włochy), Sterylizowany przez filtrację przez filtry O Średnicy Porów 0,22 µm (Sartorius Italy Srl, Viale A. Casati 4, 20835 Muggiò, MB, Włochy), uzyskując w ten sposób 0,5% (v/v) roztworów określonych przez skróty DTSA. Dodanie DMSO, aprotycznego rozpuszczalnika organicznego należącego do kategorii sulfoksydów, miało na celu ułatwienie rozpuszczania olejków eterycznych w środowisku wodnym reprezentowanym przez media hodowlane.

2.2.2. Przygotowanie rozcieńczeń olejków eterycznych

olejki eteryczne użyte w tym badaniu (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula hybrida, Melaleuca alternifolia i Thymus vulgaris) zostały wyekstrahowane metodą destylacji z parą wodną i zakupione od tego samego sprzedawcy (Prodotti Phitocosmetici Dott. Vannucci di Vannucci Daniela E C. Sas, Via la Cartaia Vecchia 3, 59021 Vaiano (PO), Włochy). Przed użyciem wszystkie rozcieńczenia EOs i EOs przechowywano w temperaturze 4°C.

2.2.3. Test dyfuzji dysku agarowego

zawiesiny komórek Burkholderii były smugowane na płytkach Petriego DTSA. Sterylne dyski z papieru filtracyjnego (Oksoid. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Włochy) o średnicy 6 mm nasączono 10 µL każdego nie rozcieńczonego EO i umieszczono na powierzchni naczyń. Ponadto na powierzchnię płytek agarowych zastosowano kontrole dodatnie i ujemne; były to odpowiednio antybiotyk cyprofloksacyna (3 µg / 10 µL) (Oxoid S. p. A. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Włochy) i roztwór DMSO 0,5% w jałowej wodzie dejonizowanej. Płytki inkubowano w temperaturze C przez 48 godzin. Po inkubacji zmierzono średnicę stref hamowania w milimetrach, w tym średnicę dysku. Czułość na EOs klasyfikowano według średnicy stref hamujących w następujący sposób: czułość dla całkowitej średnicy mniejszej niż 8 mm, Czułość dla całkowitej średnicy 9-14 mm, bardzo czułość dla całkowitej średnicy 15-19 mm i wyjątkowo czułość dla całkowitej średnicy większej niż 20 mm . Każdy test przeprowadzono w trzech egzemplarzach w trzech oddzielnych próbach.

2.3. Oznaczanie składu olejków eterycznych

analizy Kromatograficzne gazu (GC) wykonano przyrządem HP-5890 serii II wyposażonym w kolumnę kapilarną HP-5 (30 µm × 0,25 mm, grubość warstwy 0,25 µm), pracującym z następującym programem temperaturowym: 60°C przez 10 minut, rampa 5°c/min do 220°C; temperatura wtryskiwacza i czujki 250°C; gaz nośny, azot (2 mL/min); czujka, wykrywanie podwójnej jonizacji płomienia (2 mL / min); FID); Współczynnik podziału, 1 : 30; wstrzyknięcie, 0,5 µl. Identyfikacja składników została przeprowadzona dla obu kolumn przez porównanie ich czasów retencji z tymi dla czystych próbek autentycznych oraz za pomocą ich liniowych wskaźników retencji (LRI) względem serii węglowodorów. Analizy chromatografii gazowej-elektronowej spektrometrii mas uderzeniowych (GC-EIMS) przeprowadzono za pomocą chromatografu gazowego Varian CP 3800 (Varian, Inc. Palo Alto, CA) wyposażony w kolumnę kapilarną DB-5 (Agilent Technologies Hewlett-Packard, Waldbronn, Niemcy; 30 m × 0,25 mm, grubość powłoki 0,25 mm) i detektor masy pułapki jonowej Varian Saturn 2000. Warunki analityczne były następujące: temperatura wtryskiwacza i linii przesyłowej odpowiednio 250 i 240°C, temperatura pieca programowana od 60 do 240 ° C przy 3 ° C / min, gaz nośny, Hel przy 1 mL / min, wtryskiwacz bezszwowy. Identyfikację składników oparto na porównaniu czasów retencji z próbkami autentycznymi, porównaniu ich LRI względem serii N-węglowodorów oraz na komputerowym dopasowaniu do komercyjnych i domowych widm masowych zbudowanych z czystych substancji i składników znanych próbek oraz danych literaturowych MS. Ponadto masę cząsteczkową wszystkich zidentyfikowanych substancji potwierdzono metodą chromatografii gazowej-chemicznej spektrometrii mas jonizacyjnych (GC-CIMS), z zastosowaniem metanolu jako chemicznego gazu jonizacyjnego.

2.4. Analizy statystyczne

strefy hamowania u szczepów Bcc z różnych EOs analizowano przy użyciu analizy głównych składników, jak zaimplementowano w poprzednim oprogramowaniu . Test Kruskala-Wallisa z zabezpieczeniem przed błędami Bonferroni został zastosowany do porównania ogólnych stref hamowania różnych EOs przy użyciu oprogramowania Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd.).

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Skład olejków eterycznych

olejki eteryczne są bardzo złożonymi naturalnymi mieszankami, które mogą zawierać około 20-60 składników w zupełnie różnych stężeniach. Charakteryzują się dwoma lub trzema głównymi składnikami w dość wysokich stężeniach (20-70%) w porównaniu z innymi składnikami obecnymi w ilościach śladowych. Terpenoidy (głównie monoterpenoidy i seskwiterpenoidy) na ogół stanowią główne składniki, ale niektóre olejki eteryczne charakteryzują się obecnością składników aromatycznych (fenylopropanoidów) i alifatycznych, wszystkie charakteryzujące się niską masą cząsteczkową.

badane olejki eteryczne były próbkami komercyjnymi i analizowane przez GC przy użyciu jako detektora podwójnej FID i elektronowej spektrometrii mas uderzeniowych. Składniki zidentyfikowano przez porównanie czasów retencji obu kolumn z czasem retencji czystych autentycznych próbek oraz za pomocą ich liniowych wskaźników retencji (LRI) w stosunku do serii węglowodorów i danych MS z domowej biblioteki widm masowych i literatury.

zidentyfikowano prawie 100% substancji lotnych olejku eterycznego z oregano, co stanowi 77,2% utlenionych monoterpenów, głównie reprezentowanych przez karwakrol stanowiący 71,8% całego olejku eterycznego; 19,2% składników stanowiły węglowodory monoterpenowe, głównie cymen; 2.9% to seskwiterpeny, A 0,6% to seskwiterpeny natlenione.

również w przypadku olejku rozmarynowego zidentyfikowane substancje lotne wynosiły 99,9%, a główne składniki reprezentowały utlenione monoterpeny (64,6%) będące głównym lotnym 1,8-cyneolem (43,9%). Węglowodory monoterpenowe stanowiły 25,9%, głównie α-pinen. Węglowodory seskwiterpenowe wynosiły 9,1%, a natlenione seskwiterpeny zaledwie 0,3%.

ogółem zidentyfikowane składniki oleju tymiankowego wynosiły 99,5%. Substancje lotne te charakteryzowały się 53,7% węglowodorów monoterpenowych 47.9% p-cymenu i oksydowane monoterpeny 45,6%, głównie tymol (43,1%). Tylko 0,2% substancji lotnych stanowiły węglowodory seskwiterpenowe.

zidentyfikowano około 98% składników oleju goździkowego, a głównym metabolitem był eugenol (85%), typowy fenylopropanoid, podczas gdy 11,2% składników uznano za węglowodory seskwiterpenowe będące główną cząsteczką β-kariofilenu (9%).

zidentyfikowano około wszystkich (99,1%) składników M. alternifolia; głównymi związkami były utlenione monoterpeny będące 4-terpineolem głównym (39,9%). Resztę oleju reprezentowały głównie węglowodory monoterpenowe (41,4%) będące głównymi cząsteczkami γ-terpinenu (14,4%), a α-terpinenu (8,8%).

3.2. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa olejków eterycznych przeciwko szczepom Burkholderia cepacia Complex (Bcc)

aktywność przeciwdrobnoustrojowa sześciu różnych EOs (E. caryophyllata (Ec), O. vulgare (Ov), R. officinalis (Ro), L. hybrida (LH), M. alternifolia (Ma) i T. vulgaris (Tv)) została sprawdzona versusthe 18 szczepów typu Bcc wymienionych w tabeli 1 i reprezentatywnych dla 18 znanych gatunków Bcc; panel ten obejmuje szczepy pochodzenia klinicznego lub środowiskowego.

Uzyskane dane przedstawiono na rysunku 1 i przedstawiono poniżej.i) wszystkie 18 szczepów bakterii, zarówno pochodzenia klinicznego, jak i środowiskowego, wykazywało, choć w różnym stopniu, wrażliwość na każdy z sześciu badanych szczepów EOs.(ii) według Ponce et al. , trzy olejki eteryczne, czyli Ec, Tv i Ov, wykazywały bardzo wysoką moc hamującą w porównaniu do wszystkich badanych szczepów Bcc. W rzeczywistości wszyscy byli bardzo wrażliwi na te trzy EOs.(iii) co ciekawe, te trzy EOs dały hamujące halo znacznie większe niż wytwarzane przez cyprofloksacynę, co sugeruje, że są one bardziej aktywne niż ten antybiotyk.iv) pozostałe trzy EOs (Ro, Lh i Ma) wykazywały stopień hamowania wzrostu Bcc niższy niż wykazywany przez trzy EOS wymienione powyżej; jednakże wytwarzane przez nie hamujące fluorowce były podobne i w wielu przypadkach większe niż te wykazywane przez cyprofloksacynę.(v)najwyraźniej szczepy kliniczne i środowiskowe nie wykazywały różnej wrażliwości na dany EO (lub zestaw EOs), lecz różnie były wrażliwe na cyprofloksacynę (Tabela 1). Dwa z nich, tj. LMG 14294 (B. stabilis) i LMG 18943 (B. dolosa), były oporne na antybiotyk, a B. cenocepacia j2315, reprezentujący modelowy system badania zakażenia Bcc u pacjentów z mukowiscydozą, wykazywał niską wrażliwość na cyprofloksacynę. Te trzy szczepy mają pochodzenie kliniczne. Pomimo tego te same trzy szczepy były niezwykle wrażliwe na trzy najbardziej aktywne EOs.(vi)środowiskowe szczepy Bcc były znacznie bardziej wrażliwe na cyprofloksacynę niż ich kliniczne odpowiedniki.Różną wrażliwość na EOs i cyprofloksacynę potwierdzono analizą głównych składników(rycina 2). Jak pokazano w biplocie, wektory odpowiadające EOs są odmiennie zorientowane niż wektory (C+). Ponadto wektory dla Ov i Tv znacznie przyczyniły się do różnicowania czułości, potwierdzając tym samym, że najaktywniejszymi olejkami eterycznymi były T. vulgaris i O. vulgare. Wreszcie porównanie parami (Test Kruskala-Wallisa) wzorców hamowania EOs i cyprofloksacyny (fig.2) wykazało, że występują duże różnice między hamującymi halos różnych EOs i cyprofloksacyny, podkreślając obserwowane (Tabela 1, Fig. 1) różnice w sile hamowania sześciu EOs.

(a)
(a)
(b)
(b)
(a)
(a)(B)
(b)
rysunek 1

hamująca moc olejków eterycznych. Przedstawiono wyniki testu dyfuzji agaru przeprowadzonego na 18 szczepach typu Bcc. Każdy słupek histogramu reprezentuje średnią strefy hamującej uzyskaną dla każdego z analizowanych EOs. W grafice są zgłaszane odchylenia standardowe dla każdej średniej arytmetycznej uzyskane: (1) Thymus vulgaris, (2) Rosmarinus officinalis, (3) Lavandula hybrida, (4) Eugenia caryophyllata, (5) Melaleuca alternifolia, (6) Origanum vulgare, and (7) Ciprofloxacin.

Figure 2

Differences in the patterns of inhibition of essential oils. Upper panel: principal component analysis biplot of inhibitory patterns 18 Bcc strains (centroids) treated with different EOs and ciprofloxacin (C+). The percentage of variance explained by the first two principal components is reported. Dolny panel: wartości porównań par (Test Kruskala-Wallisa i Ochrona przed błędami Bonferroni) między EOs i C+. N. S.: nieistotne; *; **; ***.

4. Wnioski

w tej pracy wykonaliśmy wstępną analizę zdolności sześciu różnych olejków eterycznych do hamowania wzrostu szczepów należących do kompleksu B. cepacia, których członkowie są niebezpieczni dla pacjentów z mukowiscydozą; mogą one rzeczywiście powodować ciężkie infekcje u pacjentów z upośledzeniem odporności, takich jak cierpiący na mukowiscydozę. Pomysł ten opiera się na wcześniejszych odkryciach wykazujących, że olejki eteryczne są w stanie hamować wzrost niektórych ludzkich patogenów, takich jak E. coli, S. enteritidis, S. choleraesuis i S. typhimurium . Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nic nie jest znane na temat zdolności tych mieszanin związków chemicznych do hamowania wzrostu członków Bcc.

z tego powodu wybraliśmy sześć różnych olejków eterycznych (E. caryophyllata, O. vulgare, R. officinalis, L. officinalis, M. alternifolia i T. vulgaris), które zostały przetestowane w porównaniu z panelem zawierającym szczepy typowe znanych 18 gatunków Bcc.

skład sześciu EOs był zupełnie inny, ale mimo to wszystkie wykazywały aktywność hamującą w porównaniu do wszystkich 18 szczepów Bcc, co sugeruje, że jeden związek lub (bardziej prawdopodobne) więcej niż jeden związek (patrz poniżej) obecny w każdym olejku eterycznym może zakłócać wzrost komórek Bcc. Jednak sześć olejków eterycznych wykazało inną aktywność hamującą i zgodnie z Ponce et al. można je podzielić na dwie różne gromady; pierwsza obejmuje T. vulgaris, O. vulgare i E. caryophyllata, podczas gdy druga obejmuje R. officinalis, M. alternifolia i L. officinalis (Tabela 2). Rzeczywiście, szczepy Bcc były niezwykle wrażliwe na EOs należące do pierwszej grupy i po prostu wrażliwe na pozostałe trzy.

Constituents LRI Essential oil
Lavandula hybrida Eugenia caryophyllata Melaleuca alternifolia Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Thymus vulgaris
Tricyclene 928 0.2 tr
-Thujene 933 0.6 tr
-Pinene 941 0.4 0.2 3.8 1.7 11.5 4.3
Camphene 955 0.3 tr 0.4 4.1 0.1
Thuja-2.4(10)-diene 959 tr
Sabinene 977 0.1 tr 0.6
-Pinene 982 0.6 0.1 2.1 0.4 3.8 1.2
Myrcene 993 0.5 0.6 1.3 1.3
-Phellandrene 1006 0.4 tr 0.2
1-Hexyl acetate 1010 0.1
-3-Carene 1013 tr tr tr
1.4-Cineole 1018 0.1
-Terpinene 1020 tr 8.8 0.8 0.4
-Cymene 1027 0.3 tr 3.7 11.6 1.9 47.9
Limonene 1032 0.7 0.1 2.0 1.1 1.8 0.2
1.8-Cineole 1034 6.9 tr 2.9 0.6 43.9 0.2
()–Ocimene 1042 0.3
-Terpinene 1063 tr 14.4 1.7 0.4
cis-Sabinene hydrate 1070 0.1 tr tr
cis-Linalool oxide (furanoid) 1077 0.3
Terpinolene 1090 4.4 0.2 0.3
trans-Linalool oxide (furanoid) 1090 0.2
1-Pentyl butyrate 1094 tr
trans-Sabinene hydrate 1099 0.3
Linalool 1101 27.1 1.8 0.9 1.2
1-Octenyl acetate 1112 0.4
exo-Fenchol 1118 tr tr tr
cis-p-Menth-2-en-1-ol 1123 0.4
Terpinen-1-ol 1135 0.2
trans-Pinocarveol 1141 tr
trans-p-Menth-2-en-1-ol 1142 0.4
Camphor 1145 8.4 tr 11.3
1-Hexyl isobutyrate 1152 0.2
Isoborneol 1158 0.2
trans-Pinocamphone 1162 tr
Pinocarvone 1164 tr
Borneol 1168 3.2 0.4 4.2
Lavandulol 1171 0.6
cis-Pinocamphone 1175 tr
4-Terpineol 1178 3.9 tr 39.9 0.2 0.8
-Cymen-8-ol 1185 tr
-Terpineol 1190 1.7 4.2 0.4 2.6 0.6
1-Hexyl butyrate 1193 0.6
cis-Piperitol 1195 tr
Verbenone 1206 0.2
trans-Piperitol 1207 0.2
Nerol 1230 0.2
1-Hexyl 2-methylbutyrate 1235 0.1
1-Hexyl 3-methylbutyrate 1244 0.3
Chavicol 1252 tr
Linalyl acetate 1259 30.4
trans-Ascaridolglycol 1268 0.2
Isobornyl acetate 1287 0.2 0.7
Lavandulyl acetate 1291 3.3
Thymol 1292 1.6 43.1
Carvacrol 1301 71.8 0.4
1-Hexyl tiglate 1333 0.2
-Cubebene 1352 tr tr
Eugenol 1358 85.0
Neryl acetate 1365 0.4
-Ylangene 1373 0.2
-Copaene 1377 0.2 tr tr 0.6
Geranyl acetate 1383 1.0
-Gurjunene 1410 0.5
-Caryophyllene 1419 2.2 9.0 0.5 2.7 5.1 0.2
Lavandulyl isobutyrate 1424 0.1
trans–Bergamotene 1437 0.2 tr
-Guaiene 1440 1.4 0.2
(Z)–Farnesene 1444 0.2
-Humulene 1455 tr 1.4 0.1 0.2 0.5 tr
(E)–Farnesene 1459 1.1
Alloaromadendrene 1461 0.6
-Muurolene 1478 0.6
Germacrene D 1482 0.3
Valencene 1493 0.3
Viridiflorene 1494 1.3 0.2
Bicyclogermacrene 1496 0.7
-Muurolene 1499 0.2 0.2
-Bisabolene 1509 0.2 0.2
Lavandulyl 2-methylbutyrate 1513 0.4
trans–Cadinene 1514 0.5 0.4
-Cadinene 1524 0.6 1.8 0.9
trans-Cadina-1(2).4-diene 1534 0.2
Spathulenol 1577 0.2
Caryophyllene oxide 1582 0.6 0.5 0.6 0.3 tr
Globulol 1584 0.5
Guaiol 1597 0.2
1-epi-Cubenol 1629 0.3
T-Cadinol 1640 0.2
Cubenol 1643 0.2
-Bisabolol 1684 0.4
Monoterpene hydrocarbons 3.2 0.4 41.4 19.2 25.9 53.7
Oxygenated monoterpenes 88.2 0.0 48.7 77.2 64.6 45.6
Sesquiterpene hydrocarbons 4.7 11.2 7.6 2.9 9.1 0.2
Oxygenated sesquiterpenes 1.2 0.5 1.4 0.6 0.3 tr
Phenylpropanoids 85.0
Other derivatives 1.9 tr
Total identified 99.2 97.1 99.1 99.9 99.9 99.5
LRI: liniowe wskaźniki retencji względem szeregu węglowodorów; TR: ślady.
Tabela 2
skład (%) i główne klasy (%) sześciu olejków eterycznych użytych w tej pracy.

jednak wszystkie z nich są w stanie hamować wzrost szczepów Bcc; szczególnie interesujące i intrygujące jest stwierdzenie, że hamujące aureole wytwarzane przez większość EOs są (znacznie więcej) większe niż te wytwarzane przez cyprofloksacynę, jeden z antybiotyków stosowanych w terapii zakażeń mukowiscydozą. Jesteśmy całkowicie świadomi, że wrażliwość na dany lek lub na złożoną mieszaninę związków przeciwdrobnoustrojowych może znacznie różnić się również między szczepami należącymi do tego samego gatunku bakterii. Jednak naszym zdaniem wstępne dane przedstawione w tej pracy są szczególnie zachęcające, ponieważ pokazują, że stosowanie olejków eterycznych może stanowić alternatywny sposób walki ze wzrostem Bcc. Interesujące jest również to, że pomimo dużej liczby eksperymentów przeprowadzonych w tej pracy, nie wyizolowano mutanta BCC odpornego na którykolwiek z badanych olejków eterycznych (dane nie pokazane). Stanowi to bardzo ważne odkrycie, które zdecydowanie sugeruje, że zdolność olejków eterycznych do hamowania wzrostu komórek Bcc może być bardzo prawdopodobna ze względu na jednoczesną obecność w oleju różnych cząsteczek (których mechanizm działania jest nadal nieznany), które mogą działać w synergiczny sposób w celu antagonizowania wzrostu Bcc. Oprócz tego, naszym zdaniem, te kombinacje związków nie powinny działać na jeden cel, ale na różne cele molekularne w komórce Bcc. Jeśli tak jest, jednoczesne blokowanie aktywności różnych celów molekularnych powinno znacznie zmniejszyć prawdopodobieństwo pojawienia się mutanta zdolnego do odporności na olejki eteryczne. Jeśli ten scenariusz jest poprawny, dane te mogą utorować drogę do stosowania olejków eterycznych do zwalczania infekcji Bcc u pacjentów z mukowiscydozą.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

podziękowania

Marco Fondi i Elena Perrin są wspierani finansowo przez FEMS Advanced Fellowship (FAF 2012) i Stypendium Fundacji “Buzzati-Traverso”, odpowiednio.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.