Esplorare l’Anti-Burkholderia cepacia Complex Attività di Oli Essenziali: Un’Analisi Preliminare

Abstract

In questo lavoro abbiamo verificato la possibilità di oli essenziali estratti da sei diverse piante medicinali (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula officinalis, Melaleuca alternifolia, e Thymus vulgaris) per inibire la crescita di 18 batterica tipo di ceppi appartenenti al 18 specie conosciute di Burkholderia cepacia complex (Bcc). Questi batteri sono patogeni umani opportunistici che possono causare gravi infezioni nei pazienti immunocompromessi, in particolare quelli affetti da fibrosi cistica (CF), e sono spesso resistenti a più antibiotici. L’analisi degli aromatogrammi prodotti dai sei oli ha rivelato che, nonostante la loro diversa composizione chimica, tutti sono stati in grado di contrastare la crescita dei membri del CCN. Tuttavia, tre di loro (cioè, Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare e Thymus vulgaris) erano particolarmente attivi rispetto ai ceppi Bcc, compresi quelli che mostravano un alto grado o resistenza alla ciprofloxacina, uno degli antibiotici più usati per trattare le infezioni Bcc. Questi tre oli sono anche attivi verso ceppi sia ambientali che clinici (isolati da pazienti CF), suggerendo che potrebbero essere utilizzati in futuro per combattere le infezioni complesse di B. cepacia.

1. Introduzione

Gli oli essenziali (EOs) sono costituiti da una complessa miscela di sostanze volatili e fragranti tipicamente sintetizzate da tutti gli organi vegetali come metaboliti secondari ed estratte mediante distillazione in acqua o vapore, estrazione con solvente, espressione sotto pressione, fluido supercritico ed estrazioni di acqua subcritica . Gli EOS comprendono due gruppi biosinteticamente correlati, principalmente terpeni e terpenoidi e, secondariamente, costituenti aromatici e alifatici, tutti caratterizzati da basso peso molecolare. Le proprietà biologiche dei terpenoidi EOs non sono ben chiarite, ma una funzione di protezione delle piante contro i predatori e gli agenti patogeni microbici è postulata e potrebbero essere importanti nell’interazione delle piante con altri organismi (ad esempio, attrazione degli impollinatori). Le stesse specie vegetali possono produrre diversi chemiotipi EOs (cioè componenti chimici). Ad esempio, Thymus vulgaris, specie morfologicamente identiche con un cariotipo stabile, sono costituite da sette diversi chemotipi a seconda che il componente dominante dell’olio essenziale sia timolo, carvacrolo, linalolo, geraniolo, sabinene idrato, α-terpineolo o eucaliptolo.

Negli ultimi anni, l’emergere di resistenza batterica contro più antibiotici ha accelerato drammaticamente. Le classi di antimicrobici chinoloni/fluorochinoloni, azoli e polieni sono spesso l’ultima risorsa per trattare le infezioni; quindi le probabilità di acquisire resistenza contro questi antimicrobici sono più alte . EOs e altri estratti vegetali possiedono proprietà antibatteriche, antimicotiche e antivirali e sono stati esaminati in tutto il mondo come potenziali fonti di nuovi composti antimicrobici . Pertanto EOs e i loro costituenti possono essere considerati in futuro per ulteriori valutazioni cliniche e possibili applicazioni e come adiuvanti ai farmaci attuali . Le proprietà antimicrobiche di EOs sono state riportate in diversi studi. L’alta attività antimicrobica delle specie di Timo e Origano è stata attribuita ai loro componenti fenolici come timolo e carvacrolo e quelli di Eugenia caryophyllus, Syzygium aromaticum e Ocimum basilicum all’eugenolo . Infatti timo e origano EOs possono inibire alcuni ceppi batterici patogeni come Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis, e Salmonella typhimurium, con l’inibizione direttamente correlata al carvacrolo e timolo . I meccanismi con cui gli oli essenziali possono inibire i microrganismi coinvolgono diverse modalità di azione e in parte possono essere dovuti alla loro idrofobicità. Di conseguenza, vengono partizionati nel doppio strato lipidico della membrana cellulare, rendendolo più permeabile, portando a perdite di contenuto cellulare vitale . Ci sono meno rapporti sui meccanismi di azione della combinazione EOs o dei loro componenti purificati sui microrganismi. Includono l’inibizione sequenziale di una via biochimica comune, l’inibizione degli enzimi protettivi e l’uso di agenti attivi della parete cellulare per migliorare l’assorbimento di altri antimicrobici. La capacità degli idrocarburi di interagire con la membrana cellulare facilita la penetrazione di carvacrolo nella cellula. In molti casi l’attività deriva dalla complessa interazione tra le diverse classi di composti come fenoli, aldeidi, chetoni, alcoli, esteri, eteri o idrocarburi trovati in EOs . È probabile che sarà più difficile per i batteri sviluppare resistenza all’EOs multicomponente che agli antibiotici comuni che sono spesso composti da una sola entità molecolare . Ad esempio, la natura multicomponente dell’olio dell’albero del tè potrebbe ridurre il potenziale di resistenza a verificarsi spontaneamente, poiché potrebbero essere necessarie mutazioni multiple simultanee per superare tutte le azioni antimicrobiche di ciascuno dei componenti. Ciò significa che numerosi obiettivi dovrebbero adattarsi per superare gli effetti del petrolio .

Gli studi clinici con EOs sono scarsi. L’uso topico è la strategia più promettente al momento, sia per la pelle che per le mucose. Qualche speranza esiste per usi inalatori, ma è necessaria una valutazione clinica. Ci sono poche informazioni sulla sicurezza in relazione alla somministrazione orale di EOs, quindi è necessario un aumento delle conoscenze sulla farmacocinetica, la farmacodinamica e la potenziale tossicità di EOs somministrata per questa via .

Particolarmente interessante da questo punto di vista è la possibilità di trattare le infezioni dei pazienti affetti da fibrosi cistica (CF). Uno dei più importanti patogeni opportunistici CF è rappresentato da batteri appartenenti al complesso Burkholderia cepacia (Bcc) appartenenti al genere molto eterogeneo Burkholderia, che attualmente comprende più di settanta specie, isolate da un’ampia gamma di nicchie. Molti membri del genere possono causare infezioni in piante, animali e umani, e la maggior parte degli studi si sono quindi concentrati su queste specie patogene a causa della loro importanza clinica . Tuttavia, recentemente, è stato descritto un numero crescente di specie di Burkholderia associate alle piante o all’ambiente e in grado di fissare l’azoto, di nodulare le leguminose o di promuovere la crescita delle piante . Tra le specie patogene, i batteri Bcc , un gruppo di batteri geneticamente distinti ma fenotipicamente simili che fino ad ora comprende 18 specie batteriche strettamente correlate, sono diventati noti come patogeni opportunisti nell’uomo. Sebbene non siano considerati patogeni importanti per la normale popolazione umana, alcuni di essi sono considerati gravi minacce per specifici gruppi di pazienti come i pazienti con FC . La CF è la malattia genetica più fatale dei caucasici e la principale causa di morbilità e mortalità nei pazienti è l’infezione polmonare cronica che coinvolge diverse specie di batteri (principalmente Pseudomonas aeruginosa), funghi e virus . Per quanto riguarda le specie Bcc, la prevalenza (2009 e 2010) dell’infezione cronica varia tra lo 0 e il 12% della popolazione CF che frequenta vari centri CF . Anche se non è elevato rispetto ad altri agenti patogeni CF, infezioni Bcc correlano con prognosi più povera, degenze ospedaliere più lunghe, e un aumento del rischio di morte .

Una delle ragioni dell’alto tasso di mortalità nelle infezioni causate dalle specie Bcc è la loro elevata resistenza agli antibiotici: sono intrinsecamente resistenti a molti antibiotici e possono sviluppare resistenza in vivo essenzialmente a tutte le classi di farmaci antimicrobici . Questa elevata resistenza agli antibiotici è il risultato di meccanismi specifici per alcune classi di antibiotici e di una resistenza intrinseca, caratteristica di tutti i batteri Gram-negativi, dovuta alla cooperazione tra la barriera di membrana esterna e l’espressione dei sistemi di efflusso . Tra i sistemi di efflusso multidrug, la resistenza ai farmaci intrinseca dei batteri Gram-negativi è principalmente attribuibile agli esportatori di farmaci di tipo RND (resistance-nodulation-cell division protein family). La presenza e la distribuzione di questi tipi di proteine in alcuni genomi Burkholderia disponibili sono noti , e alcuni di questi sistemi sono stati anche sperimentalmente caratterizzati .

Nuovi agenti antimicrobici sono sempre necessari per contrastare i mutanti resistenti Bcc che continuano ad essere selezionati dagli attuali regimi terapeutici. La resistenza batterica spesso si traduce in un fallimento del trattamento che causa gravi conseguenze soprattutto nei pazienti critici. Prescrizioni antibiotiche inappropriate o non necessarie, l’uso eccessivo di antibiotici nelle industrie agricole e zootecniche e la mancanza di aderenza del paziente a regimi antibiotici completi, che selezionano tutti i batteri resistenti, sembrano essere i principali contributori all’emergere della resistenza agli antibiotici. I batteri resistenti possono anche diffondersi e diventare più ampi problemi di controllo delle infezioni, non solo all’interno delle istituzioni sanitarie ma anche all’interno delle comunità. Per questo motivo è urgente sviluppare nuove terapie antibatteriche non solo contro i batteri Bcc ma anche contro altri patogeni umani diversi . In questo contesto uno degli approcci più importanti è rappresentato dalla ricerca di nuovi farmaci naturali da fonti “insolite”; particolarmente interessanti potrebbero essere gli oli essenziali poiché sono multicomponenti e, in linea di principio, la probabilità che i batteri sviluppino resistenza a questa miscela di sostanze potrebbe essere molto minore rispetto a una singola molecola.

Pertanto, lo scopo di questo lavoro era quello di esplorare l’attività antimicrobica di sei diversi oli essenziali rispetto a un gruppo di batteri Bcc, alcuni dei quali presentano multiresistenza a diversi farmaci e con fonte clinica o ambientale, al fine di verificare la possibilità di utilizzare oli essenziali per combattere le infezioni Bcc nei pazienti affetti da FC.

2. Materiali e metodi

2.1. Ceppi batterici e condizioni di crescita

I ceppi batterici utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella 1. Sono stati coltivati sia su Triptone Soya Agar (TSA, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) medium a 37°C per due giorni o in brodo liquido di Soia triptone (TSB, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) medium a 37°C con agitazione.

Burkholderia cepacia complex strains
Strain Origin Species Sensitivity to
Eugenia caryophyllata Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Lavandula hybrida Melaleuca alternifolia Thymus vulgaris Ciprofloxacin
LMG 13010 CF B. multivorans ES ES S S S ES VS
J2315 CF B. cenocepacia ES ES S S S ES S
LMG 14294 CF B. stabilis ES ES S S S ES NS
LMG 24064 CF B. latens ES ES ES S S ES ES
LMG 24065 CF B. diffusa ES ES VS S S ES VS
LMG 18943 CF B. dolosa ES ES VS S VS ES NS
LMG 24067 CF B. seminalis ES ES S S S ES VS
LMG 24068 CF B. metallica ES ES S S S ES ES
LMG 26883 CF B. pseudomultivorans ES ES VS S S ES VS
LMG 23361 AI B. contaminas ES ES VS S S ES ES
LMG 1222 Env B. cepacia VS ES S S S ES VS
LMG 10929 Env B. vietnamiensis ES ES ES S VS ES ES
LMG 19182 Env B. ambifaria ES ES NS S S ES ES
LMG 20980 Env B. anthina ES ES VS S ES ES ES
LMG 14191 Env B. pyrrocinia ES ES VS S ES ES ES
LMG 22485 Env B. lata ES ES S S S ES ES
LMG 24066 Env B. arboris ES ES VS S S ES ES
LMG 20358 Env B. ubonensis ES ES ES S VS ES ES
CF: strain isolated from cystic fibrosis patient; Env: environmental strain; AI: animal infection; NS, S, VS, and ES: non sensibile, sensibile, molto sensibile ed estremamente sensibile, rispettivamente (secondo Ponce et al., 2003) .
Tabella 1
Elenco dei ceppi batterici utilizzati in questo lavoro e la loro sensibilità agli oli essenziali testati in questo lavoro.

2.2. Aromatogrammi
2.2.1. Preparazione di sospensioni e supporti microbici

Ogni ceppo batterico è stato coltivato a 37°C in mezzo liquido (TSB) con agitazione; la crescita è stata controllata a intervalli di tempo regolari (come lettura spettrofotometrica a OD600) fino al raggiungimento della fine della fase esponenziale di crescita. Diluizioni seriali da 1: 10 a 10-5 di ciascuna sospensione batterica sono state placcate su piastre TSA Petri per contare i microrganismi e verificare che il numero di batteri nei campioni fosse appropriato all’esecuzione dei test.

Il TSA, utilizzato per eseguire i saggi di diffusione agar, è stato arricchito con un adeguato volume di Dimetilsolfossido (DMSO, Carlo Erba Reagenti S.p.A., Strada Rivoltana km 6/7, 20090 Rodano, MI, Italia), sterilizzata per filtrazione attraverso filtri con un diametro dei pori di 0,22 µm (Sartorius Italy Srl, Viale A. Casati 4, 20835 Muggiò, MB, Italia), ottenendo così soluzioni allo 0,5% (v/v) identificate dalle abbreviazioni di DTSA. L’aggiunta di DMSO, un solvente organico aprotico appartenente alla categoria dei solfossidi, aveva lo scopo di facilitare la solubilizzazione degli oli essenziali nel mezzo acquoso rappresentato dai terreni di coltura.

2.2.2. Preparazione di Diluizioni di Oli Essenziali

Gli oli essenziali utilizzati in questo studio (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula hybrida, Melaleuca alternifolia e Thymus vulgaris) sono stati estratti tramite distillazione a vapore metodo, e acquistato dallo stesso rivenditore (Prodotti Phitocosmetici Dott. Vannucci di Vannucci Daniela e C. Sas, Via la Cartaia Vecchia 3, 59021 Vaiano (PO), Italia). Tutte le diluizioni EOs e EOs sono state conservate a 4°C prima dell’uso.

2.2.3. Analisi di diffusione del disco di Agar

Le sospensioni di cellule Burkholderia sono state striate su piastre DTSA Petri. Dischi di carta da filtro sterili (Oxoid SpA. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) di 6 mm di diametro sono stati imbevuti con 10 µL di EO non diluito e posti sulla superficie delle stoviglie. Inoltre, controlli positivi e negativi sono stati applicati sulla superficie delle piastre di agar; erano, rispettivamente, l’antibiotico ciprofloxacina (3 µg / 10 µL) (Oxoid S.p.A. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) e una soluzione di DMSO 0,5% in acqua deionizzata sterile. Le piastre sono state incubate a °C per 48 h aerobicamente. Dopo l’incubazione, il diametro delle zone di inibizione è stato misurato in millimetri, compreso il diametro del disco. La sensibilità all’EOs è stata classificata dal diametro delle zone di inibizione come segue: non sensibile per diametro totale inferiore a 8 mm, Sensibile per diametro totale 9-14 mm, molto sensibile per diametro totale 15-19 mm ed estremamente sensibile per diametro totale superiore a 20 mm . Ogni saggio è stato eseguito in triplice copia su tre prove sperimentali separate.

2.3. Determinazione di Olio Essenziale di Composizione

Gas cromatographic (GC) le analisi sono state realizzate con un HP-5890 serie II è uno strumento portatile con un HP-5 colonna capillare (30 µm × 0.25 mm, 0,25 µm spessore del film), lavorando con il seguente programma di temperatura: 60°C per 10 min, rampa di 5°C/min a 220°C; iniettore e rilevatore di temperature di 250°C; gas di trasporto, di azoto (2 mL/min); rivelatore, doppia rivelazione a ionizzazione di fiamma (FID); rapporto di divisione, 1 : 30; iniezione, 0.5 µL. L’identificazione dei componenti è stata effettuata, per entrambe le colonne, confrontando i loro tempi di ritenzione con quelli di campioni autentici puri e mediante i loro indici di ritenzione lineare (LRI) relativi alla serie di-idrocarburi. Le analisi gascromatografiche-electron impact mass spectrometry (GC-EIMS) sono state eseguite con un gascromatografo Varian CP 3800 (Varian, Inc. Palo Alto, CA) dotato di una colonna capillare DB-5 (Agilent Technologies Hewlett-Packard, Waldbronn, Germania; 30 m × 0,25 mm, spessore del rivestimento 0,25 mm) e un Varian Saturn 2000 ion trap mass detector. Le condizioni analitiche erano le seguenti: temperatura dell’iniettore e della linea di trasferimento rispettivamente a 250 e 240°C, temperatura del forno programmata da 60 a 240°C a 3 ° C/min, gas vettore, elio a 1 mL/min, iniettore splitless. L’identificazione dei costituenti è stata basata sul confronto dei tempi di conservazione con quelli dei campioni autentici, confrontando il loro LRI relativo alla serie di n-idrocarburi e sulla corrispondenza al computer con spettri di massa di libreria commerciali e fatti in casa costruiti da sostanze e componenti puri di campioni noti e dati della letteratura MS. Inoltre, i pesi molecolari di tutte le sostanze identificate sono stati confermati dalla gascromatografia – spettrometria di massa di ionizzazione chimica (GC-CIMS), utilizzando il metanolo come gas di ionizzazione chimica.

2.4. Analisi statistiche

Le zone di inibizione nei ceppi Bcc delle diverse EOS sono state analizzate utilizzando l’analisi dei componenti principali implementata nel software PRECEDENTE . Il test Kruskal-Wallis con Bonferroni error protection è stato applicato per confrontare le zone di inibizione complessive delle diverse EOS utilizzando il software Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd.).

3. Risultati e discussione

3.1. Composizione di oli essenziali

Gli oli essenziali sono miscele naturali molto complesse, che possono contenere circa 20-60 componenti a concentrazioni molto diverse. Sono caratterizzati da due o tre componenti principali a concentrazioni piuttosto elevate (20-70%) rispetto ad altri componenti presenti in tracce. I terpenoidi (principalmente monoterpenoidi e sesquiterpenoidi) rappresentano generalmente i costituenti principali ma alcuni oli essenziali sono caratterizzati dalla presenza di costituenti aromatici (fenilpropanoidi) e alifatici, tutti caratterizzati da basso peso molecolare.

Gli oli essenziali testati erano campioni commerciali e analizzati da GC utilizzando come rivelatore una spettrometria di massa a doppio impatto FID ed elettrone. I costituenti sono stati identificati confrontando i loro tempi di ritenzione di entrambe le colonne con quelli di campioni autentici puri e mediante i loro indici di ritenzione lineare (LRI) relativi alle serie di idrocarburi e ai dati MS provenienti da spettri di massa e letteratura della libreria fatta in casa.

Sono stati identificati quasi il 100% dei volatili dell’olio essenziale di origano, essendo il 77,2% dei monoterpeni ossigenati, principalmente rappresentati dal carvacrolo che rappresenta il 71,8% dell’olio essenziale totale; il 19,2% dei costituenti era rappresentato da idrocarburi monoterpenici, principalmente-cimene; 2.il 9% erano idrocarburi sesquiterpeni e lo 0,6% sesquiterpeni ossigenati.

Anche nel caso dell’olio essenziale di rosmarino i volatili identificati erano il 99,9% e i costituenti principali erano rappresentati dai monoterpeni ossigenati (64,6%) essendo il principale volatile 1,8-cineolo (43,9%). Gli idrocarburi monoterpenici erano il 25,9%, principalmente α-pinene. Gli idrocarburi sesquiterpenici erano il 9,1% e i sesquiterpeni ossigenati solo lo 0,3%.

I costituenti totali identificati dell’olio di timo erano il 99,5%. Questi volatili sono stati caratterizzati da 53.7% di idrocarburi monoterpenici essendo 47.9% p-cimene e monoterpeni ossigenati 45,6%, principalmente timolo (43,1%). Solo lo 0,2% dei volatili erano idrocarburi sesquiterpeni.

Circa il 98% dei costituenti dell’olio di chiodi di garofano è stato identificato e il principale metabolita è stato l’eugenolo (85%), un tipico fenilpropanoide, mentre l ‘ 11,2% dei costituenti è stato riconosciuto come idrocarburi sesquiterpenici essendo il β-cariofillene la molecola principale (9%).

Sono stati identificati approssimativamente tutti (99,1%) i costituenti di M. alternifolia; i composti principali erano monoterpeni ossigenati, essendo il 4-terpineolo il principale (39,9%). Il resto dell’olio era rappresentato principalmente da idrocarburi monoterpenici (41,4%) essendo γ-terpinene (14,4%) e α-terpinene (8,8%) le molecole principali.

3.2. Attività antimicrobica di Oli Essenziali contro Burkholderia cepacia Complex (Bcc) Ceppi

L’attività antimicrobica dei sei diversi EOs (E. caryophyllata (Ce), O. vulgare (Ov), R. officinalis (Ro), L. hybrida (Lh), M. alternifolia (Ma), e T. vulgaris (Tv), è stato controllato versusthe 18 Bcc tipo di ceppi elencati in Tabella 1 e rappresentante del 18 conosciuto Bcc specie; questo gruppo comprende ceppi di origine clinica o ambientale.

I dati ottenuti sono riportati nella Figura 1 e hanno mostrato quanto segue.(i)Tutti i 18 ceppi batterici, sia di origine clinica che ambientale, hanno mostrato, anche se in misura diversa, sensibilità a ciascuno dei sei EOS testati.(ii)Secondo Ponce et al. , tre oli essenziali, cioè Ce, Tv e Ov, hanno mostrato un potere inibitorio molto alto rispetto a tutti i ceppi Bcc testati. In effetti, tutti erano estremamente sensibili a questi tre EOs.(iii) Abbastanza interessante, questi tre EOs hanno dato un alone inibitorio molto più grande di quello prodotto dalla ciprofloxacina, suggerendo che sono più attivi di questo antibiotico.(iv) Gli altri tre EOs (Ro, Lh e Ma) hanno mostrato un grado di inibizione della crescita del Bcc inferiore a quello mostrato dai tre EOs sopra menzionati; tuttavia, gli aloni inibitori che hanno prodotto erano simili e in molti casi più grandi di quelli esposti dalla ciprofloxacina.(v) Apparentemente, i ceppi clinici e ambientali non hanno mostrato una diversa sensibilità a un dato EO (o a un insieme di EOs), ma erano diversamente sensibili alla ciprofloxacina (Tabella 1). Due di loro, cioè LMG 14294 (B. stabilis) e LMG 18943 (B. dolosa), erano resistenti all’antibiotico e B. cenocepacia J2315, che rappresenta il sistema modello per lo studio dell’infezione da BCC in pazienti con FC, mostrava una bassa sensibilità alla ciprofloxacina. Questi tre ceppi hanno un’origine clinica. Nonostante ciò, gli stessi tre ceppi erano estremamente sensibili ai tre EOs più attivi.(vi) I ceppi di Bcc ambientali erano molto più sensibili alla ciprofloxacina rispetto ai loro omologhi clinici.La sensibilità differenziale a EOs e ciprofloxacina è stata confermata da un’analisi dei componenti principali (Figura 2). Come mostrato nel biplot, i vettori che rappresentano EOs sono orientati in modo differenziale rispetto a quelli della ciprofloxacina (C+). Inoltre, i vettori per Ov e Tv hanno contribuito notevolmente al modello differenziale di sensibilità, confermando così che gli oli essenziali più attivi erano T. vulgaris e O. vulgare. Infine un confronto a coppie (test di Kruskal-Wallis) dei modelli di inibizione di EOs e ciprofloxacina (Figura 2) ha mostrato che sono presenti grandi differenze tra aloni inibitori di diversi EOs e ciprofloxacina, evidenziando le differenze osservate (Tabella 1, Figura 1) nel potere inibitorio dei sei EOs.

a)
a)
b)
(b)

a)
(a)b)
(b)

Figura 1

Inibitorio potere degli oli essenziali. Vengono presentati i risultati del test di diffusione agar eseguito sui ceppi di tipo Bcc 18. Ogni barra dell’istogramma rappresenta la media della zona inibitoria ottenuta per ciascuna delle EOS analizzate. Nella grafica sono riportate le deviazioni standard per ogni media aritmetica ottenuta: (1) Thymus vulgaris, (2) Rosmarinus officinalis, (3) Lavandula hybrida, (4) Eugenia caryophyllata, (5) Melaleuca alternifolia, (6) Origanum vulgare, and (7) Ciprofloxacin.

Figure 2

Differences in the patterns of inhibition of essential oils. Upper panel: principal component analysis biplot of inhibitory patterns 18 Bcc strains (centroids) treated with different EOs and ciprofloxacin (C+). The percentage of variance explained by the first two principal components is reported. Pannello inferiore: valori di confronto a coppie (test Kruskal-Wallis e protezione errori Bonferroni) tra EOs e C+. n. s. : non significativo; *; **; ***.

4. Conclusioni

In questo lavoro abbiamo effettuato un’analisi preliminare della capacità di sei diversi oli essenziali per inibire la crescita di ceppi appartenenti al B. cepacia complex, i cui membri sono pericolosi per i pazienti FC; essi, infatti, possono causare gravi infezioni nell’compromissione del sistema immunitario dei pazienti, come quelli affetti da fibrosi cistica. Questa idea si basa su precedenti risultati che dimostrano che gli oli essenziali sono in grado di inibire la crescita di alcuni patogeni umani, come E. coli, S. enteritidis, S. choleraesuis e S. typhimurium . Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nulla è noto sulla capacità di queste miscele di composti chimici di inibire la crescita dei membri del CCN.

Per questo motivo abbiamo selezionato sei diversi oli essenziali (E. caryophyllata, O. vulgare, R. officinalis, L. officinalis, M. alternifolia e T. vulgaris) che sono stati testati rispetto a un pannello che incorpora i ceppi tipo delle note specie 18 Bcc.

La composizione dei sei EOS era molto diversa ma, nonostante ciò, tutti mostravano un’attività inibitoria rispetto a tutti i 18 ceppi Bcc, suggerendo che un composto o (più probabilmente) più di un composto (vedi sotto) presente in ciascun olio essenziale potrebbe interferire con la crescita delle cellule Bcc. Tuttavia, i sei oli essenziali hanno mostrato una diversa attività inibitoria e secondo Ponce et al. possono essere divisi in due gruppi diversi; il primo comprende T. vulgaris, O. vulgare ed E. caryophyllata, mentre l’altro incorpora R. officinalis, M. alternifolia e L. officinalis (Tabella 2). In effetti, i ceppi Bcc erano estremamente sensibili all’EOs appartenente al primo gruppo e solo sensibili agli altri tre.

Constituents LRI Essential oil
Lavandula hybrida Eugenia caryophyllata Melaleuca alternifolia Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Thymus vulgaris
Tricyclene 928 0.2 tr
-Thujene 933 0.6 tr
-Pinene 941 0.4 0.2 3.8 1.7 11.5 4.3
Camphene 955 0.3 tr 0.4 4.1 0.1
Thuja-2.4(10)-diene 959 tr
Sabinene 977 0.1 tr 0.6
-Pinene 982 0.6 0.1 2.1 0.4 3.8 1.2
Myrcene 993 0.5 0.6 1.3 1.3
-Phellandrene 1006 0.4 tr 0.2
1-Hexyl acetate 1010 0.1
-3-Carene 1013 tr tr tr
1.4-Cineole 1018 0.1
-Terpinene 1020 tr 8.8 0.8 0.4
-Cymene 1027 0.3 tr 3.7 11.6 1.9 47.9
Limonene 1032 0.7 0.1 2.0 1.1 1.8 0.2
1.8-Cineole 1034 6.9 tr 2.9 0.6 43.9 0.2
()–Ocimene 1042 0.3
-Terpinene 1063 tr 14.4 1.7 0.4
cis-Sabinene hydrate 1070 0.1 tr tr
cis-Linalool oxide (furanoid) 1077 0.3
Terpinolene 1090 4.4 0.2 0.3
trans-Linalool oxide (furanoid) 1090 0.2
1-Pentyl butyrate 1094 tr
trans-Sabinene hydrate 1099 0.3
Linalool 1101 27.1 1.8 0.9 1.2
1-Octenyl acetate 1112 0.4
exo-Fenchol 1118 tr tr tr
cis-p-Menth-2-en-1-ol 1123 0.4
Terpinen-1-ol 1135 0.2
trans-Pinocarveol 1141 tr
trans-p-Menth-2-en-1-ol 1142 0.4
Camphor 1145 8.4 tr 11.3
1-Hexyl isobutyrate 1152 0.2
Isoborneol 1158 0.2
trans-Pinocamphone 1162 tr
Pinocarvone 1164 tr
Borneol 1168 3.2 0.4 4.2
Lavandulol 1171 0.6
cis-Pinocamphone 1175 tr
4-Terpineol 1178 3.9 tr 39.9 0.2 0.8
-Cymen-8-ol 1185 tr
-Terpineol 1190 1.7 4.2 0.4 2.6 0.6
1-Hexyl butyrate 1193 0.6
cis-Piperitol 1195 tr
Verbenone 1206 0.2
trans-Piperitol 1207 0.2
Nerol 1230 0.2
1-Hexyl 2-methylbutyrate 1235 0.1
1-Hexyl 3-methylbutyrate 1244 0.3
Chavicol 1252 tr
Linalyl acetate 1259 30.4
trans-Ascaridolglycol 1268 0.2
Isobornyl acetate 1287 0.2 0.7
Lavandulyl acetate 1291 3.3
Thymol 1292 1.6 43.1
Carvacrol 1301 71.8 0.4
1-Hexyl tiglate 1333 0.2
-Cubebene 1352 tr tr
Eugenol 1358 85.0
Neryl acetate 1365 0.4
-Ylangene 1373 0.2
-Copaene 1377 0.2 tr tr 0.6
Geranyl acetate 1383 1.0
-Gurjunene 1410 0.5
-Caryophyllene 1419 2.2 9.0 0.5 2.7 5.1 0.2
Lavandulyl isobutyrate 1424 0.1
trans–Bergamotene 1437 0.2 tr
-Guaiene 1440 1.4 0.2
(Z)–Farnesene 1444 0.2
-Humulene 1455 tr 1.4 0.1 0.2 0.5 tr
(E)–Farnesene 1459 1.1
Alloaromadendrene 1461 0.6
-Muurolene 1478 0.6
Germacrene D 1482 0.3
Valencene 1493 0.3
Viridiflorene 1494 1.3 0.2
Bicyclogermacrene 1496 0.7
-Muurolene 1499 0.2 0.2
-Bisabolene 1509 0.2 0.2
Lavandulyl 2-methylbutyrate 1513 0.4
trans–Cadinene 1514 0.5 0.4
-Cadinene 1524 0.6 1.8 0.9
trans-Cadina-1(2).4-diene 1534 0.2
Spathulenol 1577 0.2
Caryophyllene oxide 1582 0.6 0.5 0.6 0.3 tr
Globulol 1584 0.5
Guaiol 1597 0.2
1-epi-Cubenol 1629 0.3
T-Cadinol 1640 0.2
Cubenol 1643 0.2
-Bisabolol 1684 0.4
Monoterpene hydrocarbons 3.2 0.4 41.4 19.2 25.9 53.7
Oxygenated monoterpenes 88.2 0.0 48.7 77.2 64.6 45.6
Sesquiterpene hydrocarbons 4.7 11.2 7.6 2.9 9.1 0.2
Oxygenated sesquiterpenes 1.2 0.5 1.4 0.6 0.3 tr
Phenylpropanoids 85.0
Other derivatives 1.9 tr
Total identified 99.2 97.1 99.1 99.9 99.9 99.5
LRI: indici di ritenzione lineare relativi alla serie di-idrocarburi; tr: tracce.
Tabella 2
Composizione (%) e classi principali (%) dei sei oli essenziali utilizzati in questo lavoro.

Tuttavia, tutti sono in grado di inibire la crescita dei ceppi Bcc; particolarmente interessante e intrigante è la scoperta che gli aloni inibitori prodotti dalla maggior parte di EOs sono (molto più) più grandi di quelli prodotti dalla ciprofloxacina, uno degli antibiotici utilizzati nella terapia delle infezioni da CF. Siamo pienamente consapevoli che la sensibilità ad un dato farmaco o ad una miscela complessa di composti antimicrobici può variare fortemente anche tra ceppi appartenenti alla stessa specie batterica. Tuttavia, a nostro avviso, i dati preliminari riportati in questo lavoro sono particolarmente incoraggianti, poiché dimostrano che l’uso di oli essenziali potrebbe rappresentare un modo alternativo per combattere la crescita delle Bcc. È anche abbastanza interessante che, nonostante l’alto numero di esperimenti eseguiti in questo lavoro, nessun mutante Bcc resistente a nessuno degli oli essenziali testati è stato isolato (dati non mostrati). Questo rappresenta una scoperta molto importante, che suggerisce fortemente che la capacità degli oli essenziali di inibire la crescita delle cellule Bcc potrebbe essere molto probabilmente dovuta alla presenza simultanea nell’olio di diverse molecole (il cui meccanismo d’azione è ancora sconosciuto) che potrebbero funzionare in modo sinergico per antagonizzare la crescita del Bcc. Oltre a questo, a nostro avviso, queste combinazioni di composti non dovrebbero agire su un singolo bersaglio, ma su diversi bersagli molecolari all’interno della cellula Bcc. Se è così, il blocco simultaneo dell’attività di diversi bersagli molecolari dovrebbe ridurre fortemente la probabilità della comparsa di un mutante in grado di resistere agli oli essenziali. Se questo scenario è corretto, questi dati potrebbero aprire la strada all’uso di oli essenziali per combattere l’infezione da Bcc nei pazienti CF.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo documento.

Riconoscimenti

Marco Fondi ed Elena Perrin sono finanziariamente supportati da una FES Advanced Fellowship (FAF 2012) e da una Fellowship della Fondazione “Buzzati-Traverso”.

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