Exploration de l’activité du Complexe Anti-Burkholderia cepacia des Huiles Essentielles: Une Analyse préliminaire

Résumé

Dans ce travail, nous avons vérifié la capacité des huiles essentielles extraites de six plantes médicinales différentes (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula officinalis, Melaleuca alternifolia et Thymus vulgaris) à inhiber la croissance de 18 souches de type bactérien appartenant aux 18 espèces connues de la Complexe Burkholderia cepacia (Bcc). Ces bactéries sont des agents pathogènes humains opportunistes qui peuvent causer une infection grave chez les patients immunodéprimés, en particulier ceux atteints de fibrose kystique (FK), et sont souvent résistantes à de multiples antibiotiques. L’analyse des aromatogrammes produits par les six huiles a révélé que, malgré leur composition chimique différente, toutes étaient capables de contraster la croissance des membres du Cci. Cependant, trois d’entre eux (i.e., Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare et Thymus vulgaris) étaient particulièrement actifs par rapport aux souches de Cci, y compris celles présentant un degré élevé ou une résistance élevée à la ciprofloxacine, l’un des antibiotiques les plus utilisés pour traiter les infections de Cci. Ces trois huiles sont également actives à la fois pour les souches environnementales et cliniques (isolées de patients atteints de mucoviscidose), ce qui suggère qu’elles pourraient être utilisées à l’avenir pour lutter contre les infections du complexe B. cepacia.

1. Introduction

Les huiles essentielles (OE) consistent en un mélange complexe de substances volatiles et parfumées généralement synthétisées par tous les organes de la plante sous forme de métabolites secondaires et extraites par distillation à l’eau ou à la vapeur d’eau, extraction au solvant, expression sous pression, fluide supercritique et extractions d’eau sous-critique. Les EOS comprennent deux groupes biosynthétiquement liés, principalement des terpènes et des terpénoïdes et, secondairement, des constituants aromatiques et aliphatiques, tous caractérisés par un faible poids moléculaire. Les propriétés biologiques des terpénoïdes EOs ne sont pas bien élucidées, mais une fonction de protection des plantes contre les prédateurs et les agents pathogènes microbiens est postulée et elles pourraient être importantes dans l’interaction des plantes avec d’autres organismes (par exemple, l’attraction des pollinisateurs). Une même espèce végétale peut produire différents chimiotypes EOs (c.-à-d. des composants chimiques). Par exemple, le Thymus vulgaris, espèce morphologiquement identique avec un caryotype stable, se compose de sept chimiotypes différents selon que le composant dominant de l’huile essentielle est le thymol, le carvacrol, le linalol, le géraniol, l’hydrate de sabinène, l’α-terpinéol ou l’eucalyptol.

Au cours des dernières années, l’émergence de la résistance bactérienne aux antibiotiques multiples s’est considérablement accélérée. Les classes d’antimicrobiens quinolones / fluoroquinolones, azoles et polyènes sont souvent le dernier recours pour traiter les infections; par conséquent, les chances d’acquérir une résistance à ces antimicrobiens sont plus élevées. L’EOs et d’autres extraits de plantes possèdent des propriétés antibactériennes, antifongiques et antivirales et ont été sélectionnés dans le monde entier comme sources potentielles de nouveaux composés antimicrobiens. Ainsi, les EOS et leurs constituants peuvent, espérons-le, être considérés à l’avenir pour davantage d’évaluations cliniques et d’applications possibles et comme adjuvants aux médicaments actuels. Les propriétés antimicrobiennes de l’EOs ont été rapportées dans plusieurs études. L’activité antimicrobienne élevée des espèces de Thymus et d’Origanum a été attribuée à leurs composants phénoliques tels que le thymol et le carvacrol et ceux d’Eugenia caryophyllus, de Syzygium aromaticum et d’Ocimum basilicum à l’eugénol. En fait, le thym et l’origan EOs peuvent inhiber certaines souches bactériennes pathogènes telles que Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis et Salmonella typhimurium, l’inhibition étant directement corrélée au carvacrol et au thymol. Les mécanismes par lesquels les huiles essentielles peuvent inhiber les microorganismes impliquent différents modes d’action et peuvent en partie être dus à leur hydrophobie. En conséquence, ils sont cloisonnés dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire, la rendant plus perméable, entraînant une fuite du contenu cellulaire vital. Il y a moins de rapports sur les mécanismes d’action de la combinaison EOs ou de leurs composants purifiés sur les micro-organismes. Ils comprennent l’inhibition séquentielle d’une voie biochimique commune, l’inhibition des enzymes protectrices et l’utilisation d’agents actifs de la paroi cellulaire pour améliorer l’absorption d’autres antimicrobiens. La capacité des hydrocarbures à interagir avec la membrane cellulaire facilite la pénétration du carvacrol dans la cellule. Dans de nombreux cas, l’activité résulte de l’interaction complexe entre les différentes classes de composés tels que les phénols, les aldéhydes, les cétones, les alcools, les esters, les éthers ou les hydrocarbures présents dans les EOS. Il est probable qu’il sera plus difficile pour les bactéries de développer une résistance aux EOS à plusieurs composants qu’aux antibiotiques courants qui ne sont souvent composés que d’une seule entité moléculaire. Par exemple, la nature multicomposante de l’huile d’arbre à thé pourrait réduire le potentiel de résistance à se produire spontanément, car de multiples mutations simultanées peuvent être nécessaires pour surmonter toutes les actions antimicrobiennes de chacun des composants. Cela signifie que de nombreuses cibles devraient s’adapter pour surmonter les effets du pétrole.

Les études cliniques avec EOs sont rares. L’utilisation topique est la stratégie la plus prometteuse pour le moment, tant pour la peau que pour les muqueuses. Certains espoirs existent pour les utilisations par inhalation, mais une évaluation clinique est nécessaire. Il y a peu d’informations concernant la sécurité par rapport à l’administration orale d’EOs, de sorte qu’une augmentation des connaissances sur la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et la toxicité potentielle de l’EOs administré par cette voie est nécessaire.

La possibilité de traiter les infections des patients atteints de mucoviscidose (FK) est particulièrement intéressante de ce point de vue. L’un des agents pathogènes opportunistes les plus importants de la FC est représenté par des bactéries appartenant au complexe de Burkholderia cepacia (Bcc) appartenant au genre très hétérogène Burkholderia, qui comprend actuellement plus de soixante-dix espèces, isolées dans un large éventail de niches. De nombreux membres du genre peuvent provoquer une infection chez les plantes, les animaux et les humains, et la plupart des études se sont donc concentrées sur ces espèces pathogènes en raison de leur importance clinique. Cependant, récemment, un nombre croissant d’espèces de Burkholderia associées aux plantes ou à l’environnement et capables de fixer l’azote, de noduler les légumineuses ou de favoriser la croissance des plantes, ont été décrites. Parmi les espèces pathogènes, les bactéries Bcc, un groupe de bactéries génétiquement distinctes mais phénotypiquement similaires qui comprend jusqu’à présent 18 espèces bactériennes étroitement apparentées, sont devenues connues comme pathogènes opportunistes chez l’homme. Bien qu’ils ne soient pas considérés comme des agents pathogènes importants pour la population humaine normale, certains d’entre eux sont considérés comme des menaces graves pour des groupes de patients spécifiques tels que les patients atteints de mucoviscidose. La mucoviscidose est la maladie génétique la plus mortelle chez les Caucasiens, et la principale cause de morbidité et de mortalité chez les patients est une infection pulmonaire chronique impliquant différentes espèces de bactéries (principalement Pseudomonas aeruginosa), de champignons et de virus. En ce qui concerne les espèces de CCB, la prévalence (2009 et 2010) de l’infection chronique varierait entre 0 et 12 % de la population des FC fréquentant divers centres des FC. Bien qu’elle ne soit pas élevée par rapport à d’autres agents pathogènes de la mucoviscidose, les infections à CCI sont corrélées à un pronostic plus défavorable, à des séjours à l’hôpital plus longs et à un risque accru de décès.

L’une des raisons du taux élevé de mortalité dans les infections causées par les espèces de Cci est leur résistance élevée aux antibiotiques: elles sont intrinsèquement résistantes à de nombreux antibiotiques et peuvent développer une résistance in vivo à pratiquement toutes les classes de médicaments antimicrobiens. Cette résistance élevée aux antibiotiques est le résultat de mécanismes spécifiques à certaines classes d’antibiotiques et d’une résistance intrinsèque, caractéristique de toutes les bactéries à Gram négatif, due à la coopération entre la barrière membranaire externe et l’expression des systèmes d’efflux. Entre les systèmes d’efflux multidrogue, la résistance intrinsèque aux médicaments des bactéries à Gram négatif est principalement attribuable aux exportateurs de médicaments de type RND (resistance-nodulation-cell division protein family). La présence et la distribution de ces types de protéines dans certains génomes de Burkholderia disponibles sont connues, et certains de ces systèmes ont également été caractérisés expérimentalement.

De nouveaux agents antimicrobiens sont toujours nécessaires pour contrer les mutants résistants au Bcc qui continuent d’être sélectionnés par les schémas thérapeutiques actuels. La résistance bactérienne entraîne souvent un échec du traitement qui entraîne de graves séquelles, en particulier chez les patients gravement malades. Les prescriptions d’antibiotiques inappropriées ou inutiles, l’utilisation excessive d’antibiotiques dans les industries de l’agriculture et de l’élevage et le manque d’adhésion des patients à des schémas antibiotiques complets, qui sélectionnent tous des bactéries résistantes, semblent être les principaux contributeurs à l’émergence de la résistance aux antibiotiques. Les bactéries résistantes peuvent également se propager et devenir des problèmes plus larges de contrôle des infections, non seulement au sein des établissements de santé, mais également au sein des communautés. Pour cette raison, il est urgent de développer de nouvelles thérapies antibactériennes non seulement contre les bactéries Bcc, mais également contre d’autres agents pathogènes humains différents. Dans ce contexte, l’une des approches les plus importantes est représentée par la recherche de nouveaux médicaments naturels à partir de sources “inhabituelles”; les huiles essentielles pourraient être particulièrement intéressantes car elles sont multi-composants et, en principe, la probabilité que les bactéries développent une résistance à ce mélange de substances pourrait être bien moindre qu’à une seule molécule.

Par conséquent, le but de ce travail était d’explorer l’activité antimicrobienne de six huiles essentielles différentes par rapport à un panel de bactéries Bcc, dont certaines présentent une multirésistance à différents médicaments et de source clinique ou environnementale, afin de vérifier la possibilité d’utiliser des huiles essentielles pour lutter contre les infections Bcc chez les patients atteints de mucoviscidose.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Souches bactériennes et Conditions de croissance

Les souches bactériennes utilisées dans ce travail sont énumérées dans le tableau 1. Ils ont été cultivés soit sur Gélose de soja Tryptone (TSA, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italie) milieu à 37 ° C pendant deux jours ou dans un bouillon de soja Tryptone liquide (TSB, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italie) milieu à 37 ° C avec agitation.

Burkholderia cepacia complex strains
Strain Origin Species Sensitivity to
Eugenia caryophyllata Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Lavandula hybrida Melaleuca alternifolia Thymus vulgaris Ciprofloxacin
LMG 13010 CF B. multivorans ES ES S S S ES VS
J2315 CF B. cenocepacia ES ES S S S ES S
LMG 14294 CF B. stabilis ES ES S S S ES NS
LMG 24064 CF B. latens ES ES ES S S ES ES
LMG 24065 CF B. diffusa ES ES VS S S ES VS
LMG 18943 CF B. dolosa ES ES VS S VS ES NS
LMG 24067 CF B. seminalis ES ES S S S ES VS
LMG 24068 CF B. metallica ES ES S S S ES ES
LMG 26883 CF B. pseudomultivorans ES ES VS S S ES VS
LMG 23361 AI B. contaminas ES ES VS S S ES ES
LMG 1222 Env B. cepacia VS ES S S S ES VS
LMG 10929 Env B. vietnamiensis ES ES ES S VS ES ES
LMG 19182 Env B. ambifaria ES ES NS S S ES ES
LMG 20980 Env B. anthina ES ES VS S ES ES ES
LMG 14191 Env B. pyrrocinia ES ES VS S ES ES ES
LMG 22485 Env B. lata ES ES S S S ES ES
LMG 24066 Env B. arboris ES ES VS S S ES ES
LMG 20358 Env B. ubonensis ES ES ES S VS ES ES
CF: strain isolated from cystic fibrosis patient; Env: environmental strain; AI: animal infection; NS, S, VS, and ES: non sensible, sensible, très sensible et extrêmement sensible, respectivement (selon Ponce et al., 2003) .
Tableau 1
Liste des souches bactériennes utilisées dans ce travail et leur sensibilité aux huiles essentielles testées dans ce travail.
2.2. Aromatogrammes
2.2.1. Préparation de Suspensions microbiennes et de Milieux

Chaque souche bactérienne a été cultivée à 37°C en milieu liquide (BST) sous agitation; la croissance a été vérifiée à intervalles de temps réguliers (comme lecture spectrophotométrique à OD600) jusqu’à ce que la fin de la phase exponentielle de croissance soit atteinte. Des dilutions en série de 1:10 à 10-5 de chaque suspension bactérienne ont été plaquées sur des boîtes de Petri TSA afin de compter les microorganismes et de vérifier que le nombre de bactéries dans les échantillons était approprié à la réalisation des tests.

La TSA, utilisée pour réaliser les dosages de diffusion sur gélose, a été enrichie d’un volume approprié de Diméthylsulfoxyde (DMSO, Carlo Erba Reagenti S.p.a., Strada Rivoltana km 6/7, 20090 Rodano, MI, Italie), stérilisée par filtration à travers des filtres d’un diamètre de pores de 0,22 µm (Sartorius Italy Srl, Viale A. Casati 4, 20835 Muggiò, MB, Italie), obtenant ainsi des solutions à 0,5% (v / v) identifiées par les abréviations de DTSA. L’ajout de DMSO, solvant organique aprotique appartenant à la catégorie des sulfoxydes, avait pour but de faciliter la solubilisation des huiles essentielles dans le milieu aqueux représenté par les milieux de culture.

2.2.2. Préparation de dilutions d’Huiles Essentielles

Les huiles essentielles utilisées dans cette étude (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula hybrida, Melaleuca alternifolia et Thymus vulgaris) ont toutes été extraites par distillation à la vapeur d’eau et achetées chez le même détaillant (Prodotti Phitocosmetici Dott. Vannucci di Vannucci Daniela e C. Sas, Via la Cartaia Vecchia 3, 59021 Vaiano (PO), Italie). Toutes les dilutions EOs et EOs ont été conservées à 4°C avant utilisation.

2.2.3. Essai de diffusion sur disque d’agar

Des suspensions de cellules de Burkholderia ont été striées sur des boîtes de Pétri DTSA. Disques en papier filtre stérile (Oxoid SpA. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italie) de 6 mm de diamètre ont été imbibés de 10 µL de chaque EO non dilué, et placés à la surface des plats. De plus, des témoins positifs et négatifs ont été appliqués à la surface des plaques de gélose; il s’agissait respectivement de l’antibiotique ciprofloxacine (3 µg / 10 µL) (Oxoid S.p.A. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italie) et d’une solution de DMSO à 0,5% dans de l’eau désionisée stérile. Les plaques ont été incubées à °C pendant 48 h en aérobic. Après incubation, le diamètre des zones d’inhibition a été mesuré en millimètres, diamètre du disque compris. La sensibilité à l’EOs a été classée par le diamètre des zones d’inhibition comme suit: non sensible pour un diamètre total inférieur à 8 mm, Sensible pour un diamètre total de 9 à 14 mm, très sensible pour un diamètre total de 15 à 19 mm et extrêmement sensible pour un diamètre total supérieur à 20 mm. Chaque essai a été réalisé en trois exemplaires sur trois essais expérimentaux distincts.

2.3. Détermination de la composition des huiles essentielles

Des analyses cromatographiques de gaz (GC) ont été effectuées avec un instrument HP-5890 série II équipé d’une colonne capillaire HP-5 (30 µm × 0,25 mm, épaisseur de film de 0,25 µm), fonctionnant avec le programme de température suivant: 60 ° C pendant 10 min, rampe de 5 ° C / min à 220 ° C; températures de l’injecteur et du détecteur, 250 ° C; gaz vecteur, azote (2 mL / min); détecteur, détection par ionisation à double flamme (FID ); rapport de division, 1:30; injection, 0,5 µL. L’identification des composants a été réalisée, pour les deux colonnes, par comparaison de leurs temps de rétention avec ceux d’échantillons purs authentiques et au moyen de leurs indices de rétention linéaires (LRI) par rapport à la série des-hydrocarbures. Les analyses par chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse par impact électronique (GC-EIMS) ont été effectuées avec un chromatographe en phase gazeuse Varian CP 3800 (Varian, Inc. Palo Alto, CA) équipé d’une colonne capillaire DB-5 (Agilent Technologies Hewlett-Packard, Waldbronn, Allemagne; 30 m × 0,25 mm, épaisseur de revêtement 0,25 mm) et d’un détecteur de masse à piège ionique Varian Saturn 2000. Les conditions analytiques étaient les suivantes: température de l’injecteur et de la ligne de transfert à 250 et 240 °C, respectivement, température du four programmée de 60 à 240 °C à 3 °C/min, gaz vecteur, hélium à 1 mL/min, injecteur sans fractionnement. L’identification des constituants a été basée sur la comparaison des temps de rétention avec ceux des échantillons authentiques, la comparaison de leur LRI par rapport à la série de n-hydrocarbures et sur une correspondance informatique avec des spectres de masse de bibliothèque commerciaux et maison construits à partir de substances pures et de composants d’échantillons connus et de données de la littérature MS. De plus, les poids moléculaires de toutes les substances identifiées ont été confirmés par chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse par ionisation chimique (GC-CIMS), en utilisant du méthanol comme gaz d’ionisation chimique.

2.4. Des analyses statistiques

Les zones d’inhibition des souches de Bcc des différents EOS ont été analysées en utilisant l’analyse en composantes principales telle qu’implémentée dans les logiciels PRÉCÉDENTS. Le test de Kruskal-Wallis avec protection contre les erreurs de Bonferroni a été appliqué pour comparer les zones d’inhibition globales des différents EOs à l’aide du logiciel Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd.).

3. Résultats et discussion

3.1. Composition des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des mélanges naturels très complexes, qui peuvent contenir environ 20 à 60 composants à des concentrations très différentes. Ils sont caractérisés par deux ou trois composants principaux à des concentrations assez élevées (20-70%) par rapport aux autres composants présents à l’état de traces. Les terpénoïdes (principalement les monoterpénoïdes et les sesquiterpénoïdes) représentent généralement les constituants principaux mais certaines huiles essentielles sont caractérisées par la présence de constituants aromatiques (phénylpropanoïdes) et aliphatiques, tous caractérisés par un faible poids moléculaire.

Les huiles essentielles testées étaient des échantillons commerciaux et analysées par GC en utilisant comme détecteur une spectrométrie de masse à double FID et à impact électronique. Les constituants ont été identifiés par comparaison de leurs temps de rétention des deux colonnes avec ceux d’échantillons authentiques purs et au moyen de leurs indices de rétention linéaire (LRI) par rapport aux séries d’hydrocarbures et aux données MS provenant de spectres de masse et de la littérature maison.

Près de 100% des volatiles de l’huile essentielle d’origan ont été identifiés, soit 77,2% de monoterpènes oxygénés, principalement représentés par le carvacrol représentant 71,8% de l’huile essentielle totale; 19,2% des constituants étaient représentés par des hydrocarbures monoterpéniques, principalement le cymène; 2.9% étaient des hydrocarbures sesquiterpéniques et 0,6% étaient des sesquiterpènes oxygénés.

Toujours dans le cas de l’huile essentielle de romarin, les volatiles identifiés étaient de 99,9% et les constituants principaux étaient représentés par les monoterpènes oxygénés (64,6%) étant le principal 1,8-cinéole volatil (43,9%). Les hydrocarbures monoterpéniques étaient à 25,9%, principalement l’α-pinène. Les hydrocarbures sesquiterpéniques étaient à 9,1% et les sesquiterpènes oxygénés n’étaient que de 0,3%.

Le total des constituants identifiés de l’huile de thym était de 99,5 %. Ces substances volatiles ont été caractérisées par 53,7% d’hydrocarbures monoterpéniques étant 47.9% de p-cymène et 45,6% de monoterpènes oxygénés, principalement du thymol (43,1%). Seulement 0,2% des substances volatiles étaient des hydrocarbures sesquiterpéniques.

Environ 98% des constituants de l’huile de girofle ont été identifiés et le métabolite principal était l’eugénol (85%), un phénylpropanoïde typique, tandis que 11,2% des constituants étaient reconnus comme des hydrocarbures sesquiterpéniques étant le β-caryophyllène la molécule principale (9%).

Environ la totalité (99,1%) des constituants de M. alternifolia ont été identifiés ; les composés principaux étaient des monoterpènes oxygénés, le 4-terpinéol étant le principal (39,9%). Le reste de l’huile était principalement représenté par des hydrocarbures monoterpéniques (41,4%) étant les molécules principales du γ-terpinène (14,4%) et du α-terpinène (8,8%).

3.2. Activité antimicrobienne des Huiles Essentielles contre les Souches du Complexe Burkholderia cepacia (Bcc)

L’activité antimicrobienne des six EOs différents (E. caryophyllata (Ec), O. vulgare (Ov), R. officinalis (Ro), L. hybrida (Lh), M. alternifolia (Ma) et T. vulgaris (Tv)) a été vérifiée vers les 18 souches de type Bcc énumérées dans le tableau 1 et représentatives des 18 espèces de Bcc connues; ce panel comprend des souches d’origine clinique ou environnementale.

Les données obtenues sont rapportées dans la figure 1 et montrent ce qui suit.(i) Toutes les 18 souches bactériennes, d’origine clinique et environnementale, présentaient, bien que dans une mesure différente, une sensibilité à chacune des six EO testées.(ii) Selon Ponce et coll. , trois huiles essentielles, c’est-à-dire Ec, Tv et Ov, présentaient un pouvoir inhibiteur très élevé par rapport à toutes les souches de Cci testées. En effet, tous étaient extrêmement sensibles à ces trois EOs.(iii) Assez intéressant, ces trois EOS ont donné un halo inhibiteur beaucoup plus grand que celui produit par la ciprofloxacine, suggérant qu’ils sont plus actifs que cet antibiotique.(iv) Les trois autres EOS (Ro, Lh et Ma) présentaient un degré d’inhibition de la croissance du Cci inférieur à celui des trois EOs mentionnés ci-dessus; cependant, les halos inhibiteurs qu’ils produisaient étaient similaires et dans de nombreux cas plus importants que ceux exposés par la ciprofloxacine.(v) Apparemment, les souches cliniques et environnementales ne présentaient pas une sensibilité différente à une OE donnée (ou à un ensemble d’OE), mais elles étaient différemment sensibles à la ciprofloxacine (tableau 1). Deux d’entre eux, à savoir LMG 14294 (B. stabilis) et LMG 18943 (B. dolosa), étaient résistants à l’antibiotique et B. cenocepacia J2315, représentant le système modèle pour l’étude de l’infection par le CCI chez les patients atteints de mucoviscidose, présentait une faible sensibilité à la ciprofloxacine. Ces trois souches ont une origine clinique. Malgré cela, les trois mêmes souches étaient extrêmement sensibles aux trois EOs les plus actifs.(vi) Les souches de cci environnementales étaient beaucoup plus sensibles à la ciprofloxacine que leurs homologues cliniques.La sensibilité différentielle à l’EOs et à la ciprofloxacine a été confirmée par une analyse en composantes principales (figure 2). Comme le montre le biplot, les vecteurs représentant EOs sont orientés différemment de ceux de la ciprofloxacine (C +). De plus, les vecteurs de Vo et de Tv ont grandement contribué au modèle différentiel de sensibilité, confirmant ainsi que les huiles essentielles les plus actives étaient T. vulgaris et O. vulgare. Enfin, une comparaison par paires (test de Kruskal-Wallis) des schémas d’inhibition de l’EOs et de la ciprofloxacine (Figure 2) a montré que de grandes différences entre les halos inhibiteurs de différents EOs et ciprofloxacine sont présentes, mettant en évidence les différences observées (Tableau 1, Figure 1) dans le pouvoir inhibiteur des six EOs.

(a)
(a)
(b)
(b)
(a)
(a) (b)
(b)
Figure 1

Pouvoir inhibiteur des huiles essentielles. Les résultats du test de diffusion sur gélose effectué sur les 18 souches de type Bcc sont présentés. Chaque barre de l’histogramme représente la moyenne de la zone inhibitrice obtenue pour chacun des EOs analysés. Dans les graphiques sont reportés les écarts types pour chaque moyenne arithmétique obtenue: (1) Thymus vulgaris, (2) Rosmarinus officinalis, (3) Lavandula hybrida, (4) Eugenia caryophyllata, (5) Melaleuca alternifolia, (6) Origanum vulgare, and (7) Ciprofloxacin.

Figure 2

Differences in the patterns of inhibition of essential oils. Upper panel: principal component analysis biplot of inhibitory patterns 18 Bcc strains (centroids) treated with different EOs and ciprofloxacin (C+). The percentage of variance explained by the first two principal components is reported. Panneau inférieur: valeurs des comparaisons par paires (test de Kruskal-Wallis et protection contre les erreurs de Bonferroni) entre EOs et C+. n.s. : non significatif; *; **; ***.

4. Conclusions

Dans ce travail, nous avons effectué une analyse préliminaire de la capacité de six huiles essentielles différentes à inhiber la croissance de souches appartenant au complexe B. cepacia, dont les membres sont dangereux pour les patients atteints de mucoviscidose; en effet, ils peuvent provoquer des infections graves chez des patients immunodéprimés, tels que ceux atteints de fibrose kystique. Cette idée s’appuie sur des résultats antérieurs démontrant que les huiles essentielles sont capables d’inhiber la croissance de certains agents pathogènes humains, tels que E. coli, S. enteritidis, S. choleraesuis et S. typhimurium. Cependant, à notre connaissance, rien n’est connu sur la capacité de ces mélanges de composés chimiques à inhiber la croissance des membres du Cci.

Pour cette raison, nous avons sélectionné six huiles essentielles différentes (E. caryophyllata, O. vulgare, R. officinalis, L. officinalis, M. alternifolia et T. vulgaris) qui ont été testées par rapport à un panel intégrant les souches types des 18 espèces de Cci connues.

La composition des six EOS était très différente mais, malgré cela, toutes présentaient une activité inhibitrice par rapport à l’ensemble des 18 souches de Bcc, suggérant qu’un composé ou (plus probablement) plus d’un composé (voir ci-dessous) présent dans chaque huile essentielle pourrait interférer avec la croissance cellulaire du Bcc. Cependant, les six huiles essentielles ont montré une activité inhibitrice différente et selon Ponce et al. ils pourraient être divisés en deux groupes différents; le premier comprend T. vulgaris, O. vulgare et E. caryophyllata, tandis que l’autre intègre R. officinalis, M. alternifolia et L. officinalis (tableau 2). En effet, les souches de Bcc étaient extrêmement sensibles aux EOs appartenant au premier groupe et juste sensibles aux trois autres.

Constituents LRI Essential oil
Lavandula hybrida Eugenia caryophyllata Melaleuca alternifolia Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Thymus vulgaris
Tricyclene 928 0.2 tr
-Thujene 933 0.6 tr
-Pinene 941 0.4 0.2 3.8 1.7 11.5 4.3
Camphene 955 0.3 tr 0.4 4.1 0.1
Thuja-2.4(10)-diene 959 tr
Sabinene 977 0.1 tr 0.6
-Pinene 982 0.6 0.1 2.1 0.4 3.8 1.2
Myrcene 993 0.5 0.6 1.3 1.3
-Phellandrene 1006 0.4 tr 0.2
1-Hexyl acetate 1010 0.1
-3-Carene 1013 tr tr tr
1.4-Cineole 1018 0.1
-Terpinene 1020 tr 8.8 0.8 0.4
-Cymene 1027 0.3 tr 3.7 11.6 1.9 47.9
Limonene 1032 0.7 0.1 2.0 1.1 1.8 0.2
1.8-Cineole 1034 6.9 tr 2.9 0.6 43.9 0.2
()–Ocimene 1042 0.3
-Terpinene 1063 tr 14.4 1.7 0.4
cis-Sabinene hydrate 1070 0.1 tr tr
cis-Linalool oxide (furanoid) 1077 0.3
Terpinolene 1090 4.4 0.2 0.3
trans-Linalool oxide (furanoid) 1090 0.2
1-Pentyl butyrate 1094 tr
trans-Sabinene hydrate 1099 0.3
Linalool 1101 27.1 1.8 0.9 1.2
1-Octenyl acetate 1112 0.4
exo-Fenchol 1118 tr tr tr
cis-p-Menth-2-en-1-ol 1123 0.4
Terpinen-1-ol 1135 0.2
trans-Pinocarveol 1141 tr
trans-p-Menth-2-en-1-ol 1142 0.4
Camphor 1145 8.4 tr 11.3
1-Hexyl isobutyrate 1152 0.2
Isoborneol 1158 0.2
trans-Pinocamphone 1162 tr
Pinocarvone 1164 tr
Borneol 1168 3.2 0.4 4.2
Lavandulol 1171 0.6
cis-Pinocamphone 1175 tr
4-Terpineol 1178 3.9 tr 39.9 0.2 0.8
-Cymen-8-ol 1185 tr
-Terpineol 1190 1.7 4.2 0.4 2.6 0.6
1-Hexyl butyrate 1193 0.6
cis-Piperitol 1195 tr
Verbenone 1206 0.2
trans-Piperitol 1207 0.2
Nerol 1230 0.2
1-Hexyl 2-methylbutyrate 1235 0.1
1-Hexyl 3-methylbutyrate 1244 0.3
Chavicol 1252 tr
Linalyl acetate 1259 30.4
trans-Ascaridolglycol 1268 0.2
Isobornyl acetate 1287 0.2 0.7
Lavandulyl acetate 1291 3.3
Thymol 1292 1.6 43.1
Carvacrol 1301 71.8 0.4
1-Hexyl tiglate 1333 0.2
-Cubebene 1352 tr tr
Eugenol 1358 85.0
Neryl acetate 1365 0.4
-Ylangene 1373 0.2
-Copaene 1377 0.2 tr tr 0.6
Geranyl acetate 1383 1.0
-Gurjunene 1410 0.5
-Caryophyllene 1419 2.2 9.0 0.5 2.7 5.1 0.2
Lavandulyl isobutyrate 1424 0.1
trans–Bergamotene 1437 0.2 tr
-Guaiene 1440 1.4 0.2
(Z)–Farnesene 1444 0.2
-Humulene 1455 tr 1.4 0.1 0.2 0.5 tr
(E)–Farnesene 1459 1.1
Alloaromadendrene 1461 0.6
-Muurolene 1478 0.6
Germacrene D 1482 0.3
Valencene 1493 0.3
Viridiflorene 1494 1.3 0.2
Bicyclogermacrene 1496 0.7
-Muurolene 1499 0.2 0.2
-Bisabolene 1509 0.2 0.2
Lavandulyl 2-methylbutyrate 1513 0.4
trans–Cadinene 1514 0.5 0.4
-Cadinene 1524 0.6 1.8 0.9
trans-Cadina-1(2).4-diene 1534 0.2
Spathulenol 1577 0.2
Caryophyllene oxide 1582 0.6 0.5 0.6 0.3 tr
Globulol 1584 0.5
Guaiol 1597 0.2
1-epi-Cubenol 1629 0.3
T-Cadinol 1640 0.2
Cubenol 1643 0.2
-Bisabolol 1684 0.4
Monoterpene hydrocarbons 3.2 0.4 41.4 19.2 25.9 53.7
Oxygenated monoterpenes 88.2 0.0 48.7 77.2 64.6 45.6
Sesquiterpene hydrocarbons 4.7 11.2 7.6 2.9 9.1 0.2
Oxygenated sesquiterpenes 1.2 0.5 1.4 0.6 0.3 tr
Phenylpropanoids 85.0
Other derivatives 1.9 tr
Total identified 99.2 97.1 99.1 99.9 99.9 99.5
LRI : indices de rétention linéaires par rapport à la série des -hydrocarbures ; tr: traces.
Tableau 2
Composition (%) et classes principales (%) des six huiles essentielles utilisées dans ce travail.

Cependant, tous sont capables d’inhiber la croissance des souches de Bcc; la découverte que les halos inhibiteurs produits par la plupart des EOS sont (beaucoup plus) plus grands que ceux produits par la ciprofloxacine, l’un des antibiotiques utilisés dans le traitement des infections par la mucoviscidose, est particulièrement intéressante et intrigante. Nous sommes tout à fait conscients que la sensibilité à un médicament donné ou à un mélange complexe de composés antimicrobiens peut également varier fortement entre les souches appartenant à la même espèce bactérienne. Cependant, à notre avis, les données préliminaires rapportées dans ce travail sont particulièrement encourageantes, car elles démontrent que l’utilisation d’huiles essentielles pourrait représenter un moyen alternatif de lutter contre la croissance du Cci. Il est également très intéressant de noter que, malgré le nombre élevé d’expériences effectuées dans ce travail, aucun mutant Bcc résistant à l’une des huiles essentielles testées n’a été isolé (données non représentées). Cela représente une découverte très importante, ce qui suggère fortement que la capacité des huiles essentielles à inhiber la croissance des cellules Bcc pourrait être très probablement due à la présence simultanée dans l’huile de différentes molécules (dont le mécanisme d’action est encore inconnu) qui pourraient agir de manière synergique pour antagoniser la croissance du Bcc. De plus, à notre avis, ces combinaisons de composés ne devraient pas agir sur une seule cible, mais sur différentes cibles moléculaires au sein de la cellule Bcc. Si tel est le cas, le blocage simultané de l’activité de différentes cibles moléculaires devrait fortement diminuer la probabilité d’apparition d’un mutant capable de résister aux huiles essentielles. Si ce scénario est correct, ces données pourraient ouvrir la voie à l’utilisation d’huiles essentielles pour lutter contre l’infection par le CCI chez les patients atteints de mucoviscidose.

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

Marco Fondi et Elena Perrin sont soutenus financièrement par une bourse FEMS Advanced Fellowship (FAF 2012) et une bourse de la Fondation “Buzzati-Traverso”, respectivement.

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