Explorando la Actividad del Complejo Anti-Burkholderia cepacia de los Aceites Esenciales: Un Análisis Preliminar

Resumen

En este trabajo hemos comprobado la capacidad de los aceites esenciales extraídos de seis plantas medicinales diferentes (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula officinalis, Melaleuca alternifolia y Thymus vulgaris) para inhibir el crecimiento de 18 cepas de tipo bacteriano pertenecientes a las 18 especies conocidas de Complejo Burkholderia cepacia (Bcc). Estas bacterias son patógenos humanos oportunistas que pueden causar infecciones graves en pacientes inmunodeprimidos, especialmente aquellos afectados por fibrosis quística (FQ), y a menudo son resistentes a múltiples antibióticos. El análisis de los aromatogramas producidos por los seis aceites reveló que, a pesar de su diferente composición química, todos ellos fueron capaces de contrastar el crecimiento de los miembros de Bcc. Sin embargo, tres de ellos (es decir,, Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare y Thymus vulgaris) fueron particularmente activos frente a las cepas de Ccb, incluidas las que presentaban un alto grado o resistencia a ciprofloxacino, uno de los antibióticos más utilizados para tratar las infecciones por Ccb. Estos tres aceites también son activos para cepas ambientales y clínicas (aislados de pacientes con FQ), lo que sugiere que podrían usarse en el futuro para combatir las infecciones del complejo B. cepacia.

1. Introducción

Los aceites esenciales (EOs) consisten en una mezcla compleja de sustancias volátiles y fragantes sintetizadas típicamente por todos los órganos de la planta como metabolitos secundarios y extraídas por destilación de agua o vapor, extracción con solventes, expresión a presión, fluido supercrítico y extracciones subcríticas de agua . Los EOs incluyen dos grupos relacionados biosintéticamente, principalmente terpenos y terpenoides y, en segundo lugar, constituyentes aromáticos y alifáticos, todos ellos caracterizados por un bajo peso molecular. Las propiedades biológicas de los terpenoides de EOs no están bien dilucidadas, pero se postula una función de protección de las plantas contra depredadores y patógenos microbianos y podrían ser importantes en la interacción de las plantas con otros organismos (por ejemplo, la atracción de polinizadores). La misma especie de planta puede producir diferentes quimiotipos de EOs (es decir, componentes químicos). Por ejemplo, Thymus vulgaris, especie morfológicamente idéntica con un cariotipo estable, consta de siete quimiotipos diferentes dependiendo de si el componente dominante del aceite esencial es timol, carvacrol, linalol, geraniol, hidrato de sabineno, α-terpineol o eucaliptol.

En los últimos años, la aparición de resistencia bacteriana contra múltiples antibióticos se ha acelerado drásticamente. Las clases de antimicrobianos quinolonas/fluoroquinolonas, azoles y polienos a menudo son el último recurso para tratar infecciones; por lo tanto, las posibilidades de adquirir resistencia a estos antimicrobianos son mayores . EOs y otros extractos de plantas poseen propiedades antibacterianas, antifúngicas y antivirales y han sido examinados en todo el mundo como fuentes potenciales de nuevos compuestos antimicrobianos . Por lo tanto, es de esperar que los EOs y sus componentes se consideren en el futuro para más evaluaciones clínicas y posibles aplicaciones, y como adyuvantes de los medicamentos actuales . Las propiedades antimicrobianas de los EOs se han descrito en varios estudios. La alta actividad antimicrobiana de las especies de Timo y Origanum se ha atribuido a sus componentes fenólicos como timol y carvacrol y los de Eugenia caryophyllus, Syzygium aromaticum y Ocimum basilicum al eugenol . De hecho, los EOs de tomillo y orégano pueden inhibir algunas cepas bacterianas patógenas como Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis y Salmonella typhimurium, con la inhibición directamente correlacionada con el carvacrol y el timol . Los mecanismos por los cuales los aceites esenciales pueden inhibir los microorganismos implican diferentes modos de acción y en parte pueden deberse a su hidrofobicidad. Como resultado, se dividen en la bicapa lipídica de la membrana celular, haciéndola más permeable, lo que conduce a la fuga de contenidos celulares vitales . Hay menos informes sobre los mecanismos de acción de la combinación de EOs o sus componentes purificados en microorganismos. Incluyen la inhibición secuencial de una vía bioquímica común, la inhibición de enzimas protectoras y el uso de agentes activos de la pared celular para mejorar la absorción de otros antimicrobianos. La capacidad de los hidrocarburos para interactuar con la membrana celular facilita la penetración del carvacrol en la célula. En muchos casos, la actividad es el resultado de la compleja interacción entre las diferentes clases de compuestos, como fenoles, aldehídos, cetonas, alcoholes, ésteres, éteres o hidrocarburos que se encuentran en el EOs . Es probable que sea más difícil para las bacterias desarrollar resistencia a los EOs multicomponentes que a los antibióticos comunes que a menudo están compuestos de una sola entidad molecular . Por ejemplo, la naturaleza multicomponente del aceite de árbol de té podría reducir el potencial de resistencia que ocurre espontáneamente, ya que se pueden requerir múltiples mutaciones simultáneas para superar todas las acciones antimicrobianas de cada uno de los componentes. Esto significa que numerosos objetivos tendrían que adaptarse para superar los efectos del petróleo .

Los estudios clínicos con EOs son escasos. El uso tópico es la estrategia más prometedora en este momento, tanto para la piel como para las membranas mucosas. Existe cierta esperanza para los usos inhalatorios, pero se necesita una evaluación clínica. Hay poca información sobre la seguridad en relación con la administración oral de EOs, por lo que se requiere un aumento en el conocimiento sobre la farmacocinética, la farmacodinámica y la toxicidad potencial de EOs administrado por esta vía .

Particularmente interesante desde este punto de vista es la posibilidad de tratar infecciones de pacientes con fibrosis quística (FQ). Uno de los patógenos oportunistas más importantes de la FQ está representado por bacterias pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia (Bcc) pertenecientes al género muy heterogéneo Burkholderia, que actualmente comprende más de setenta especies, aisladas de una amplia gama de nichos. Muchos miembros del género pueden causar infección en plantas, animales y humanos, y la mayoría de los estudios se han centrado en estas especies patógenas debido a su importancia clínica . Sin embargo, recientemente, se describió un número creciente de especies de Burkholderia asociadas con plantas o con el medio ambiente y capaces de fijar nitrógeno, nodular leguminosas o promover el crecimiento de las plantas . Entre las especies patógenas, las bacterias Bcc, un grupo de bacterias genéticamente distintas pero fenotípicamente similares que hasta ahora comprende 18 especies bacterianas estrechamente relacionadas, se han conocido como patógenos oportunistas en los seres humanos. Aunque no se consideran patógenos importantes para la población humana normal, algunos de ellos se consideran amenazas graves para grupos de pacientes específicos, como los pacientes con FQ . La FQ es la enfermedad genética más mortal de los caucásicos, y la principal causa de morbilidad y mortalidad en los pacientes es la infección pulmonar crónica que afecta a diferentes especies de bacterias (principalmente Pseudomonas aeruginosa), hongos y virus . En cuanto a las especies de Ccb, la prevalencia (2009 y 2010) de infección crónica varía entre el 0 y el 12% de la población con FQ que asiste a varios centros de FQ . Aunque no es alta en comparación con otros patógenos de la FQ, las infecciones por Ccb se correlacionan con un pronóstico más precario, estancias hospitalarias más largas y un mayor riesgo de muerte .

Una de las razones de la alta tasa de mortalidad en infecciones causadas por especies de Bcc es su alta resistencia a los antibióticos: son intrínsecamente resistentes a muchos antibióticos y pueden desarrollar resistencia in vivo a esencialmente todas las clases de medicamentos antimicrobianos . Esta alta resistencia a los antibióticos es el resultado de mecanismos específicos para ciertas clases de antibióticos y de una resistencia intrínseca, característica de todas las bacterias gramnegativas, debido a la cooperación entre la barrera de la membrana externa y la expresión de los sistemas de eflujo . Entre los sistemas de eflujo de múltiples fármacos, la resistencia intrínseca a los medicamentos de las bacterias gramnegativas es atribuible principalmente a los exportadores de medicamentos de tipo RND (familia de proteínas de división celular de nodulación de resistencia). Se conoce la presencia y distribución de este tipo de proteínas en algunos genomas de Burkholderia disponibles , y algunos de estos sistemas también se han caracterizado experimentalmente .

Siempre se necesitan nuevos agentes antimicrobianos para contrarrestar los mutantes resistentes a los Ccb que siguen siendo seleccionados por los regímenes terapéuticos actuales. La resistencia bacteriana a menudo resulta en un fracaso del tratamiento que causa secuelas graves, especialmente en pacientes críticos . Las recetas de antibióticos inadecuadas o innecesarias, el uso excesivo de antibióticos en las industrias agrícola y ganadera y la falta de adherencia de los pacientes a regímenes completos de antibióticos, todos los cuales seleccionan bacterias resistentes, parecen ser los principales contribuyentes a la aparición de resistencia a los antibióticos. Las bacterias resistentes también pueden propagarse y convertirse en problemas de control de infecciones más amplios, no solo dentro de las instituciones de salud, sino también dentro de las comunidades. Por esta razón, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevas terapias antibacterianas no solo contra las bacterias Bcc, sino también contra otros patógenos humanos diferentes . En este contexto, uno de los enfoques más importantes está representado por la búsqueda de nuevos medicamentos naturales de fuentes “inusuales”; particularmente interesantes podrían ser los aceites esenciales, ya que son multicomponentes y, en principio, la probabilidad de que las bacterias desarrollen resistencia a esta mezcla de sustancias podría ser mucho menor que a una sola molécula.

Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue explorar la actividad antimicrobiana de seis aceites esenciales diferentes versus un panel de bacterias Bcc, algunas de las cuales exhiben multirresistencia a diferentes medicamentos y con fuente clínica o ambiental, con el fin de verificar la posibilidad de usar aceites esenciales para combatir las infecciones por Bcc en pacientes con FQ.

2. Materiales y Métodos

2.1. Cepas Bacterianas y Condiciones de crecimiento

Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo se enumeran en la Tabla 1. Se cultivaban en Agar Triptónico de Soja (TSA, Oxoid S. p. A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) medio a 37°C durante dos días o en caldo de Soja de Triptona líquido (TSB, Oxoid S. p. A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) medio a 37°C con agitación.

Burkholderia cepacia complex strains
Strain Origin Species Sensitivity to
Eugenia caryophyllata Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Lavandula hybrida Melaleuca alternifolia Thymus vulgaris Ciprofloxacin
LMG 13010 CF B. multivorans ES ES S S S ES VS
J2315 CF B. cenocepacia ES ES S S S ES S
LMG 14294 CF B. stabilis ES ES S S S ES NS
LMG 24064 CF B. latens ES ES ES S S ES ES
LMG 24065 CF B. diffusa ES ES VS S S ES VS
LMG 18943 CF B. dolosa ES ES VS S VS ES NS
LMG 24067 CF B. seminalis ES ES S S S ES VS
LMG 24068 CF B. metallica ES ES S S S ES ES
LMG 26883 CF B. pseudomultivorans ES ES VS S S ES VS
LMG 23361 AI B. contaminas ES ES VS S S ES ES
LMG 1222 Env B. cepacia VS ES S S S ES VS
LMG 10929 Env B. vietnamiensis ES ES ES S VS ES ES
LMG 19182 Env B. ambifaria ES ES NS S S ES ES
LMG 20980 Env B. anthina ES ES VS S ES ES ES
LMG 14191 Env B. pyrrocinia ES ES VS S ES ES ES
LMG 22485 Env B. lata ES ES S S S ES ES
LMG 24066 Env B. arboris ES ES VS S S ES ES
LMG 20358 Env B. ubonensis ES ES ES S VS ES ES
CF: strain isolated from cystic fibrosis patient; Env: environmental strain; AI: animal infection; NS, S, VS, and ES: no sensible, sensible, muy sensible, y extremadamente sensible, respectivamente (según Ponce et al., 2003) .
la Tabla 1
Lista de cepas bacterianas utilizadas en este trabajo y su sensibilidad a los aceites esenciales evaluados en este trabajo.

2.2. Aromatogramas
2.2.1. Preparación de Suspensiones y Medios Microbianos

Cada cepa bacteriana se cultivó a 37 ° C en medio líquido (TSB) con agitación; el crecimiento se comprobó a intervalos de tiempo regulares (como lectura espectrofotométrica en OD600) hasta que se alcanzó el final de la fase exponencial de crecimiento. Se colocaron diluciones seriadas de 1 : 10 a 10-5 de cada suspensión bacteriana en placas de Petri TSA para contar los microorganismos y verificar que el número de bacterias en las muestras era adecuado para la realización de las pruebas.

TSA, utilizado para realizar los ensayos de difusión de agar, se enriqueció con un volumen adecuado de Dimetilsulfóxido (DMSO, Carlo Erba Reagenti S. p. a., Strada Rivoltana km 6/7, 20090 Rodano, MI, Italia), esterilizada por filtración a través de filtros con un diámetro de poros de 0,22 µm (Sartorius Italy Srl, Viale A. Casati 4, 20835 Muggiò, MB, Italia), obteniendo así soluciones al 0,5% (v/v) identificadas por las abreviaturas de DTSA. La adición de DMSO, un solvente orgánico aprótico perteneciente a la categoría de sulfóxidos, tenía el propósito de facilitar la solubilización de los aceites esenciales en el medio acuoso representado por los medios de cultivo.

2.2.2. Preparación de Diluciones de Aceites Esenciales

Los aceites esenciales utilizados en este estudio (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula hybrida, Melaleuca alternifolia y Thymus vulgaris) se extrajeron por destilación al vapor y se compraron al mismo minorista (Prodotti Phitocosmetici Dott. Vannucci di Vannucci Daniela e C. Sas, Via la Cartaia Vecchia 3, 59021 Vaiano (PO), Italia). Todas las diluciones de EOs y de EOs se almacenaron a 4°C antes de su uso.

2.2.3. Ensayo de Difusión de Disco de Agar

Las suspensiones de células de Burkholderia se rayaron en placas de Petri DTSA. Discos de papel de filtro estériles (Oxoid SpA. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) de 6 mm de diámetro se empaparon con 10 µL de EO no diluido y se colocaron en la superficie de los platos. Además, se aplicaron controles positivos y negativos a la superficie de las placas de agar; fueron, respectivamente, el antibiótico ciprofloxacino (3 µg/10 µL) (Oxoid S. p. A. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italia) y una solución de DMSO al 0,5% en agua desionizada estéril. Las placas se incubaron a °C durante 48 h aeróbicamente. Después de la incubación, se midió el diámetro de las zonas de inhibición en milímetros, incluido el diámetro del disco. La sensibilidad al EOs se clasificó por el diámetro de las zonas de inhibición de la siguiente manera: no sensible para el diámetro total menor de 8 mm, Sensible para el diámetro total de 9-14 mm, muy sensible para el diámetro total de 15-19 mm y extremadamente sensible para el diámetro total mayor de 20 mm. Cada ensayo se realizó por triplicado en tres corridas experimentales.

2.3. Determinación de la Composición de Aceites Esenciales

Los análisis cromatográficos de gas (GC) se realizaron con un instrumento HP-5890 serie II equipado con una columna capilar HP-5 (30 µm × 0,25 mm, espesor de película de 0,25 µm), que funciona con el siguiente programa de temperatura: 60°C durante 10 min, rampa de 5°C/min a 220°C; temperaturas del inyector y el detector, 250°C; gas portador, nitrógeno (2 mL/min); detector, detección de ionización de doble llama (FID); relación de división, 1 : 30; inyección, 0,5 µL. La identificación de los componentes se realizó, para ambas columnas, comparando sus tiempos de retención con los de muestras auténticas puras y por medio de sus índices de retención lineal (IRL) relativos a la serie de hidrocarburos. Los análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas de impacto de electrones (GC-EIMS) se realizaron con un cromatógrafo de gases Varian CP 3800 (Varian, Inc. Palo Alto, CA) equipado con una columna capilar DB-5 (Agilent Technologies Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemania; 30 m × 0,25 mm, espesor de revestimiento 0,25 mm) y un detector de masas de trampa de iones Varian Saturn 2000. Las condiciones analíticas fueron las siguientes: temperatura del inyector y de la línea de transferencia a 250 y 240°C, respectivamente, temperatura del horno programada de 60 a 240°C a 3°C/min, gas portador, helio a 1 mL/min, inyector sin división. La identificación de los constituyentes se basó en la comparación de los tiempos de retención con los de las muestras auténticas, comparando su IRL en relación con la serie de n-hidrocarburos y en la comparación por computadora con espectros de masas de biblioteca comerciales y caseros construidos a partir de sustancias y componentes puros de muestras conocidas y datos de literatura de EM . Además, los pesos moleculares de todas las sustancias identificadas se confirmaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas de ionización química (GC-CIMS), utilizando metanol como gas de ionización química.

2.4. Análisis estadísticos

Las zonas de inhibición de las cepas de Ccb de los diferentes EOs se analizaron utilizando el análisis de componentes principales implementado en el software ANTERIOR . La prueba de Kruskal-Wallis con protección contra errores de Bonferroni se aplicó para comparar las zonas de inhibición generales de los diferentes EOs utilizando el software Analyse-it (Analyse-it Software, Ltd.).

3. Resultados y Discusión

3.1. Composición de Aceites esenciales

Los aceites esenciales son mezclas naturales muy complejas, que pueden contener entre 20 y 60 componentes a concentraciones muy diferentes. Se caracterizan por dos o tres componentes principales en concentraciones bastante altas (20-70%) en comparación con otros componentes presentes en cantidades mínimas. Los terpenoides (principalmente monoterpenoides y sesquiterpenoides) generalmente representan los componentes principales, pero algunos aceites esenciales se caracterizan por la presencia de componentes aromáticos (fenilpropanoides) y alifáticos, todos caracterizados por su bajo peso molecular.

Los aceites esenciales probados fueron muestras comerciales y analizados por GC utilizando como detector un FID dual y espectrometría de masas de impacto de electrones. Los constituyentes se identificaron comparando sus tiempos de retención de ambas columnas con los de muestras auténticas puras y por medio de sus índices de retención lineal (IRL) en relación con la serie de hidrocarburos y datos de MS de espectros de masas y literatura de biblioteca casera.

Se identificaron casi el 100% de los volátiles del aceite esencial de orégano, siendo el 77,2% de los monoterpenos oxigenados, representados principalmente por carvacrol que representa el 71,8% del aceite esencial total; el 19,2% de los constituyentes estuvieron representados por hidrocarburos monoterpénicos, principalmente-cimeno; 2.el 9% eran sesquiterpenos hidrocarburos y el 0,6% sesquiterpenos oxigenados.

También en el caso del aceite esencial de romero, los volátiles identificados fueron del 99,9% y los constituyentes principales estuvieron representados por monoterpenos oxigenados (64,6%), siendo el 1,8-cineol volátil principal (43,9%). Los hidrocarburos monoterpénicos fueron del 25,9%, principalmente α-pineno. Los hidrocarburos sesquiterpénicos fueron de 9,1% y los sesquiterpenos oxigenados de solo 0,3%.

El total de constituyentes identificados del aceite de tomillo fue del 99,5%. Estos volátiles se caracterizaron por un 53,7% de hidrocarburos monoterpénicos de 47.9% de p-cimeno y monoterpenos oxigenados 45,6%, principalmente timol (43,1%). Solo el 0,2% de los volátiles eran hidrocarburos sesquiterpénicos.

Se identificó aproximadamente el 98% de los componentes del aceite de clavo y el metabolito principal fue eugenol (85%), un fenilpropanoide típico, mientras que el 11,2% de los componentes se reconocieron como hidrocarburos sesquiterpénicos, siendo el β-cariofileno la molécula principal (9%).

Se identificaron aproximadamente todos (99,1%) de los constituyentes de M. alternifolia; los compuestos principales eran monoterpenos oxigenados, siendo el 4-terpineol el principal (39,9%). El resto del aceite estaba representado principalmente por hidrocarburos monoterpénicos (41,4%) siendo el γ-terpineno (14,4%) y el α-terpineno (8,8%) las moléculas principales.

3.2. Actividad antimicrobiana de los Aceites Esenciales frente a cepas del Complejo Burkholderia cepacia (Bcc)

Se comprobó la actividad antimicrobiana de las seis cepas diferentes de EOs [E. caryophyllata (Ec), O. vulgare (Ov), R. officinalis (Ro), L. hybrida (Lh), M. alternifolia (Ma) y T. vulgaris (Tv)] versuslas 18 cepas de tipo Bcc enumeradas en la Tabla 1 y representativas de las 18 especies conocidas de Bcc; este panel incluye cepas de origen clínico o ambiental.

Los datos obtenidos se presentan en la Figura 1 y muestran lo siguiente.i) Todas las 18 cepas bacterianas, tanto de origen clínico como ambiental, mostraron, aunque en distinta medida, sensibilidad a cada una de las seis cepas de EOs analizadas.(ii)Según Ponce et al. , tres aceites esenciales, es decir, Ec, Tv y Ov, exhibieron un poder inhibitorio muy alto en comparación con todas las cepas de Ccb analizadas. De hecho, todos ellos eran extremadamente sensibles a estas tres EOs.(iii) Curiosamente, estos tres EOs dieron un halo inhibitorio mucho más grande que el producido por ciprofloxacino, lo que sugiere que son más activos que este antibiótico.(iv) Los otros tres EOs (Ro, Lh y Ma) mostraron un grado de inhibición del crecimiento de Ccb inferior al mostrado por los tres EOs mencionados anteriormente; sin embargo, los halos inhibidores que produjeron fueron similares y en muchos casos mayores que los mostrados por ciprofloxacino.v) Al parecer, las cepas clínicas y ambientales no mostraron una sensibilidad diferente a un EO determinado (o a un conjunto de EOs), pero sí una sensibilidad diferente a ciprofloxacino (Tabla 1). Dos de ellos, es decir, LMG 14294 (B. stabilis) y LMG 18943 (B. dolosa), fueron resistentes al antibiótico y B. cenocepacia J2315, que representa el sistema modelo para el estudio de la infección por Ccb en pacientes con FQ, mostró una baja sensibilidad a ciprofloxacino. Estas tres cepas tienen un origen clínico. A pesar de esto, las mismas tres cepas eran extremadamente sensibles a las tres EOs más activas.vi) Las cepas ambientales de Ccb eran mucho más sensibles al ciprofloxacino que sus homólogos clínicos.La sensibilidad diferencial a EOs y ciprofloxacino se confirmó mediante un análisis de componentes principales (Figura 2). Como se muestra en la biplaza, los vectores que representan el EOs están orientados de manera diferente a los de ciprofloxacino (C+). Además, los vectores para Ov y Tv contribuyeron en gran medida en el patrón diferencial de sensibilidad, confirmando así que los aceites esenciales más activos fueron T. vulgaris y O. vulgare. Por último, una comparación de pares (prueba de Kruskal-Wallis) de los patrones de inhibición de EOs y ciprofloxacino (Figura 2) mostró que existen grandes diferencias entre los halos inhibidores de diferentes EOS y ciprofloxacino, destacando las diferencias observadas (Tabla 1, Figura 1) en el poder inhibitorio de los seis EOs.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figura 1.

Inhibitoria poder de los aceites esenciales. Se presentan los resultados del ensayo de difusión de agar realizado en las 18 cepas de tipo Ccb. Cada barra del histograma representa la media de la zona inhibitoria obtenida para cada una de las EOs analizadas. En los gráficos se reportan las desviaciones estándar para cada media aritmética obtenida: (1) Thymus vulgaris, (2) Rosmarinus officinalis, (3) Lavandula hybrida, (4) Eugenia caryophyllata, (5) Melaleuca alternifolia, (6) Origanum vulgare, and (7) Ciprofloxacin.

Figure 2

Differences in the patterns of inhibition of essential oils. Upper panel: principal component analysis biplot of inhibitory patterns 18 Bcc strains (centroids) treated with different EOs and ciprofloxacin (C+). The percentage of variance explained by the first two principal components is reported. Panel inferior: valores de comparación de pares (prueba de Kruskal-Wallis y protección contra errores de Bonferroni) entre EOs y C+. n.s.: no significativo; *; **; ***.

4. Conclusiones

En este trabajo hemos realizado un análisis preliminar de la capacidad de seis aceites esenciales diferentes para inhibir el crecimiento de cepas pertenecientes al complejo B. cepacia, cuyos miembros son peligrosos para los pacientes con FQ; de hecho, pueden causar infecciones graves en pacientes inmunocomprometidos, como los afectados por fibrosis quística. Esta idea se basa en hallazgos previos que demuestran que los aceites esenciales son capaces de inhibir el crecimiento de algunos patógenos humanos, como E. coli, S. enteritidis, S. choleraesuis y S. typhimurium . Sin embargo, hasta donde sabemos, no se sabe nada sobre la capacidad de estas mezclas de compuestos químicos para inhibir el crecimiento de miembros de Ccb.

Por esta razón, seleccionamos seis aceites esenciales diferentes (E. caryophyllata, O. vulgare, R. officinalis, L. officinalis, M. alternifolia y T. vulgaris) que se probaron frente a un panel que incluía las cepas tipo de las 18 especies conocidas de Ccb.

La composición de los seis EOs fue bastante diferente, pero, a pesar de esto, todos ellos exhibieron una actividad inhibitoria en comparación con las 18 cepas de Ccb, lo que sugiere que un compuesto o (más probablemente) más de un compuesto (ver más adelante) presente en cada aceite esencial podría interferir con el crecimiento de las células de Ccb. Sin embargo, los seis aceites esenciales mostraron una actividad inhibitoria diferente y de acuerdo con Ponce et al. pueden dividirse en dos grupos diferentes; el primero incluye a T. vulgaris, O. vulgare y E. caryophyllata, mientras que el otro incluye a R. officinalis, M. alternifolia y L. officinalis (cuadro 2). De hecho, las cepas de Ccb eran extremadamente sensibles a los EOs pertenecientes al primer grupo y solo sensibles a los otros tres.

Constituents LRI Essential oil
Lavandula hybrida Eugenia caryophyllata Melaleuca alternifolia Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Thymus vulgaris
Tricyclene 928 0.2 tr
-Thujene 933 0.6 tr
-Pinene 941 0.4 0.2 3.8 1.7 11.5 4.3
Camphene 955 0.3 tr 0.4 4.1 0.1
Thuja-2.4(10)-diene 959 tr
Sabinene 977 0.1 tr 0.6
-Pinene 982 0.6 0.1 2.1 0.4 3.8 1.2
Myrcene 993 0.5 0.6 1.3 1.3
-Phellandrene 1006 0.4 tr 0.2
1-Hexyl acetate 1010 0.1
-3-Carene 1013 tr tr tr
1.4-Cineole 1018 0.1
-Terpinene 1020 tr 8.8 0.8 0.4
-Cymene 1027 0.3 tr 3.7 11.6 1.9 47.9
Limonene 1032 0.7 0.1 2.0 1.1 1.8 0.2
1.8-Cineole 1034 6.9 tr 2.9 0.6 43.9 0.2
()–Ocimene 1042 0.3
-Terpinene 1063 tr 14.4 1.7 0.4
cis-Sabinene hydrate 1070 0.1 tr tr
cis-Linalool oxide (furanoid) 1077 0.3
Terpinolene 1090 4.4 0.2 0.3
trans-Linalool oxide (furanoid) 1090 0.2
1-Pentyl butyrate 1094 tr
trans-Sabinene hydrate 1099 0.3
Linalool 1101 27.1 1.8 0.9 1.2
1-Octenyl acetate 1112 0.4
exo-Fenchol 1118 tr tr tr
cis-p-Menth-2-en-1-ol 1123 0.4
Terpinen-1-ol 1135 0.2
trans-Pinocarveol 1141 tr
trans-p-Menth-2-en-1-ol 1142 0.4
Camphor 1145 8.4 tr 11.3
1-Hexyl isobutyrate 1152 0.2
Isoborneol 1158 0.2
trans-Pinocamphone 1162 tr
Pinocarvone 1164 tr
Borneol 1168 3.2 0.4 4.2
Lavandulol 1171 0.6
cis-Pinocamphone 1175 tr
4-Terpineol 1178 3.9 tr 39.9 0.2 0.8
-Cymen-8-ol 1185 tr
-Terpineol 1190 1.7 4.2 0.4 2.6 0.6
1-Hexyl butyrate 1193 0.6
cis-Piperitol 1195 tr
Verbenone 1206 0.2
trans-Piperitol 1207 0.2
Nerol 1230 0.2
1-Hexyl 2-methylbutyrate 1235 0.1
1-Hexyl 3-methylbutyrate 1244 0.3
Chavicol 1252 tr
Linalyl acetate 1259 30.4
trans-Ascaridolglycol 1268 0.2
Isobornyl acetate 1287 0.2 0.7
Lavandulyl acetate 1291 3.3
Thymol 1292 1.6 43.1
Carvacrol 1301 71.8 0.4
1-Hexyl tiglate 1333 0.2
-Cubebene 1352 tr tr
Eugenol 1358 85.0
Neryl acetate 1365 0.4
-Ylangene 1373 0.2
-Copaene 1377 0.2 tr tr 0.6
Geranyl acetate 1383 1.0
-Gurjunene 1410 0.5
-Caryophyllene 1419 2.2 9.0 0.5 2.7 5.1 0.2
Lavandulyl isobutyrate 1424 0.1
trans–Bergamotene 1437 0.2 tr
-Guaiene 1440 1.4 0.2
(Z)–Farnesene 1444 0.2
-Humulene 1455 tr 1.4 0.1 0.2 0.5 tr
(E)–Farnesene 1459 1.1
Alloaromadendrene 1461 0.6
-Muurolene 1478 0.6
Germacrene D 1482 0.3
Valencene 1493 0.3
Viridiflorene 1494 1.3 0.2
Bicyclogermacrene 1496 0.7
-Muurolene 1499 0.2 0.2
-Bisabolene 1509 0.2 0.2
Lavandulyl 2-methylbutyrate 1513 0.4
trans–Cadinene 1514 0.5 0.4
-Cadinene 1524 0.6 1.8 0.9
trans-Cadina-1(2).4-diene 1534 0.2
Spathulenol 1577 0.2
Caryophyllene oxide 1582 0.6 0.5 0.6 0.3 tr
Globulol 1584 0.5
Guaiol 1597 0.2
1-epi-Cubenol 1629 0.3
T-Cadinol 1640 0.2
Cubenol 1643 0.2
-Bisabolol 1684 0.4
Monoterpene hydrocarbons 3.2 0.4 41.4 19.2 25.9 53.7
Oxygenated monoterpenes 88.2 0.0 48.7 77.2 64.6 45.6
Sesquiterpene hydrocarbons 4.7 11.2 7.6 2.9 9.1 0.2
Oxygenated sesquiterpenes 1.2 0.5 1.4 0.6 0.3 tr
Phenylpropanoids 85.0
Other derivatives 1.9 tr
Total identified 99.2 97.1 99.1 99.9 99.9 99.5
LRI: índices de retención lineal relativos a la serie de hidrocarburos; tr: trazas.
Tabla 2
Composición (%) y clases principales (%) de los seis aceites esenciales utilizados en este trabajo.

sin Embargo, todos ellos son capaces de inhibir el crecimiento de cepas Cco; particularmente interesante e intrigante es el hallazgo de que los halos inhibitorios producidos por la mayoría de los EOs son (mucho más) más grandes que los producidos por la ciprofloxacina, uno de los antibióticos utilizados en la terapia de infecciones por FQ. Somos plenamente conscientes de que la sensibilidad a un medicamento determinado o a una mezcla compleja de compuestos antimicrobianos también puede variar considerablemente entre cepas pertenecientes a la misma especie bacteriana. Sin embargo, en nuestra opinión, los datos preliminares reportados en este trabajo son particularmente alentadores, ya que demuestran que el uso de aceites esenciales podría representar una forma alternativa de combatir el crecimiento de Bcc. También es muy interesante que, a pesar del gran número de experimentos realizados en este trabajo, no se aisló ningún mutante de Ccb resistente a ninguno de los aceites esenciales probados (datos no mostrados). Esto representa un hallazgo muy importante, que sugiere fuertemente que la capacidad de los aceites esenciales para inhibir el crecimiento de células de Ccb podría deberse muy probablemente a la presencia simultánea en el aceite de diferentes moléculas (cuyo mecanismo de acción aún se desconoce) que podrían funcionar de manera sinérgica para antagonizar el crecimiento de Ccb. Además de esto, en nuestra opinión, estas combinaciones de compuestos no deben actuar en un solo objetivo, sino en diferentes objetivos moleculares dentro de la célula Bcc. Si esto es así, el bloqueo simultáneo de la actividad de diferentes blancos moleculares debería disminuir fuertemente la probabilidad de la aparición de un mutante capaz de resistir los aceites esenciales. Si este escenario es correcto, estos datos podrían allanar el camino para el uso de aceites esenciales para combatir la infección por Ccb en pacientes con FQ.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este documento.

Reconocimientos

Marco Fondi y Elena Perrin cuentan con el apoyo financiero de una Beca Avanzada de FEMS (FAF 2012) y una Beca de la Fundación” Buzzati-Traverso”, respectivamente.

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