Erforschung der Anti-Burkholderia cepacia-Komplexaktivität ätherischer Öle: Eine vorläufige Analyse

Zusammenfassung

In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit der ätherischen Öle, die aus sechs verschiedenen Heilpflanzen (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula officinalis, Melaleuca alternifolia und Thymus vulgaris) extrahiert wurden, überprüft, das Wachstum von 18 Bakterienstämmen zu hemmen, die zu den 18 bekannten Arten der Burkholderia cepacia Komplex (Bcc). Diese Bakterien sind opportunistische Humanpathogene, die bei immungeschwächten Patienten, insbesondere bei Patienten mit Mukoviszidose (CF), schwere Infektionen verursachen können und häufig gegen mehrere Antibiotika resistent sind. Die Analyse der Aromatogramme der sechs Öle ergab, dass alle trotz ihrer unterschiedlichen chemischen Zusammensetzung das Wachstum der Bcc-Mitglieder kontrastieren konnten. Drei von ihnen (d.h., Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare und Thymus vulgaris) waren gegenüber den Bcc-Stämmen besonders aktiv, einschließlich derjenigen, die einen hohen Grad oder eine hohe Resistenz gegen Ciprofloxacin aufweisen, eines der am häufigsten verwendeten Antibiotika zur Behandlung von Bcc-Infektionen. Diese drei Öle sind auch gegenüber Umwelt- und klinischen Stämmen (isoliert von CF-Patienten) aktiv, was darauf hindeutet, dass sie in Zukunft zur Bekämpfung von B. cepacia-Komplexinfektionen eingesetzt werden könnten.

1. Einführung

Ätherische Öle (EOs) bestehen aus einer komplexen Mischung flüchtiger und duftender Substanzen, die typischerweise von allen Pflanzenorganen als Sekundärmetaboliten synthetisiert und durch Wasser- oder Wasserdampfdestillation, Lösungsmittelextraktion, Expression unter Druck, überkritische Flüssigkeit und unterkritische Wasserextraktionen extrahiert werden . Sie umfassen zwei biosynthetisch verwandte Gruppen, hauptsächlich Terpene und Terpenoide und in zweiter Linie aromatische und aliphatische Bestandteile, die alle durch ein niedriges Molekulargewicht gekennzeichnet sind. Biologische Eigenschaften von EOs-Terpenoiden sind nicht gut geklärt, aber eine Funktion zum Schutz von Pflanzen vor Raubtieren und mikrobiellen Krankheitserregern wird postuliert und sie könnten für die Interaktion von Pflanzen mit anderen Organismen wichtig sein (z. B. Anziehung von Bestäubern). Dieselbe Pflanzenart kann verschiedene EOs-Chemotypen (d. H. Chemische Komponenten) produzieren. Zum Beispiel besteht Thymus vulgaris, morphologisch identische Spezies mit einem stabilen Karyotyp, aus sieben verschiedenen Chemotypen, je nachdem, ob die dominierende Komponente des ätherischen Öls Thymol, Carvacrol, Linalool, Geraniol, Sabinenhydrat, α-Terpineol oder Eukalyptol ist.

In den letzten Jahren hat sich die Entstehung bakterieller Resistenzen gegen mehrere Antibiotika dramatisch beschleunigt. Die Klassen Chinolone / Fluorchinolone, Azol und Polyen von antimikrobiellen Mitteln sind oft der letzte Ausweg zur Behandlung von Infektionen; daher sind die Chancen, Resistenzen gegen diese antimikrobiellen Mittel zu entwickeln, höher . EOs und andere Pflanzenextrakte besitzen antibakterielle, antimykotische und antivirale Eigenschaften und wurden weltweit als potenzielle Quellen für neuartige antimikrobielle Verbindungen untersucht . Daher können EOs und ihre Bestandteile hoffentlich in Zukunft für weitere klinische Bewertungen und mögliche Anwendungen sowie als Adjuvantien für aktuelle Medikamente in Betracht gezogen werden . Die antimikrobiellen Eigenschaften von EOs wurden in mehreren Studien berichtet. Die hohe antimikrobielle Aktivität von Thymus- und Origanum-Arten wurde ihren phenolischen Komponenten wie Thymol und Carvacrol und denen von Eugenia caryophyllus, Syzygium aromaticum und Ocimum basilicum Eugenol zugeschrieben . Tatsächlich können Thymian- und Oreganoöl einige pathogene Bakterienstämme wie Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis und Salmonella typhimurium hemmen, wobei die Hemmung direkt mit Carvacrol und Thymol korreliert . Die Mechanismen, durch die ätherische Öle Mikroorganismen hemmen können, beinhalten unterschiedliche Wirkweisen und können teilweise auf ihre Hydrophobie zurückzuführen sein. Infolgedessen werden sie in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran verteilt, wodurch sie durchlässiger wird, was zum Austreten lebenswichtiger Zellinhalte führt . Es gibt weniger Berichte über die Wirkmechanismen dieser Kombination oder ihrer gereinigten Komponenten auf Mikroorganismen. Sie umfassen die sequentielle Hemmung eines gemeinsamen biochemischen Weges, die Hemmung schützender Enzyme und die Verwendung von Zellwandwirkstoffen, um die Aufnahme anderer antimikrobieller Mittel zu verbessern. Die Fähigkeit von Kohlenwasserstoffen, mit der Zellmembran zu interagieren, erleichtert das Eindringen von Carvacrol in die Zelle. In vielen Fällen resultiert die Aktivität aus der komplexen Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Verbindungsklassen wie Phenolen, Aldehyden, Ketonen, Alkoholen, Estern, Ethern oder Kohlenwasserstoffen, die in EOs vorkommen . Es ist wahrscheinlich, dass es für Bakterien schwieriger sein wird, Resistenzen gegen die Mehrkomponenten-EOs zu entwickeln als gegen gängige Antibiotika, die oft nur aus einer einzigen molekularen Einheit bestehen . Zum Beispiel könnte die Mehrkomponentennatur von Teebaumöl das Potenzial für spontane Resistenzen verringern, da mehrere gleichzeitige Mutationen erforderlich sein können, um alle antimikrobiellen Wirkungen jeder der Komponenten zu überwinden. Dies bedeutet, dass sich zahlreiche Ziele anpassen müssten, um die Auswirkungen des Öls zu überwinden .

Klinische Studien mit EOs sind rar. Die topische Anwendung ist derzeit die vielversprechendste Strategie für Haut und Schleimhäute. Einige Hoffnung besteht für Inhalationsanwendungen, aber eine klinische Bewertung ist erforderlich. Es liegen nur wenige Informationen zur Sicherheit in Bezug auf die orale Verabreichung von EOs vor, daher ist eine Erweiterung des Wissens über die Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und die potenzielle Toxizität von EOs erforderlich, die auf diesem Weg verabreicht werden .

Besonders interessant aus dieser Sicht ist die Möglichkeit, Infektionen von Mukoviszidose (CF)-Patienten zu behandeln. Einer der wichtigsten opportunistischen CF-Erreger sind Bakterien des Burkholderia cepacia-Komplexes (Bcc) der sehr heterogenen Gattung Burkholderia, die derzeit mehr als siebzig Arten umfasst und aus einer Vielzahl von Nischen isoliert ist. Viele Mitglieder der Gattung können Infektionen bei Pflanzen, Tieren und Menschen verursachen, und die meisten Studien haben sich daher aufgrund ihrer klinischen Bedeutung auf diese pathogenen Arten konzentriert . In jüngster Zeit wurde jedoch eine zunehmende Anzahl von Burkholderia-Arten beschrieben, die mit Pflanzen oder mit der Umwelt assoziiert sind und Stickstoff binden, Hülsenfrüchte knöten oder das Pflanzenwachstum fördern können . Unter den pathogenen Arten sind die Bcc-Bakterien, eine Gruppe genetisch unterschiedlicher, aber phänotypisch ähnlicher Bakterien, die bisher 18 eng verwandte Bakterienarten umfasst, als opportunistische Erreger beim Menschen bekannt geworden. Obwohl sie nicht als wichtige Krankheitserreger für die normale menschliche Bevölkerung angesehen werden, gelten einige von ihnen als ernsthafte Bedrohungen für bestimmte Patientengruppen wie CF-Patienten . CF ist die tödlichste genetische Erkrankung der Kaukasier , und die Hauptursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten ist eine chronische Lungeninfektion, an der verschiedene Bakterienarten (hauptsächlich Pseudomonas aeruginosa), Pilze und Viren beteiligt sind . In Bezug auf Bcc-Arten wird berichtet, dass die Prävalenz (2009 und 2010) chronischer Infektionen zwischen 0 und 12% der CF-Population variiert, die verschiedene CF-Zentren besucht . Obwohl es im Vergleich zu anderen CF-Erregern nicht hoch ist, korrelieren Bcc-Infektionen mit einer schlechteren Prognose, längeren Krankenhausaufenthalten und einem erhöhten Todesrisiko .

Einer der Gründe für die hohe Mortalitätsrate bei Infektionen durch Bcc-Arten ist ihre hohe Antibiotikaresistenz: Sie sind intrinsisch resistent gegen viele Antibiotika und können in vivo Resistenzen gegen im Wesentlichen alle Klassen antimikrobieller Wirkstoffe entwickeln . Diese hohe Antibiotikaresistenz ist das Ergebnis von Mechanismen, die für bestimmte Antibiotikaklassen spezifisch sind, und einer intrinsischen Resistenz, die für alle gramnegativen Bakterien charakteristisch ist, aufgrund der Zusammenarbeit zwischen der äußeren Membranbarriere und der Expression von Effluxsystemen . Zwischen Multidrug-Efflux-Systemen ist die intrinsische Arzneimittelresistenz gramnegativer Bakterien hauptsächlich auf Arzneimittelexporteure vom Typ RND (Resistance-Nodulation-cell Division Protein Family) zurückzuführen . Das Vorhandensein und die Verteilung dieser Arten von Proteinen in einigen verfügbaren Burkholderia-Genomen sind bekannt , und einige dieser Systeme wurden auch experimentell charakterisiert .Neue antimikrobielle Wirkstoffe werden immer benötigt, um den Bcc-resistenten Mutanten entgegenzuwirken, die weiterhin von aktuellen Therapieschemata ausgewählt werden. Bakterielle Resistenzen führen häufig zu Behandlungsversagen, das insbesondere bei kritisch kranken Patienten schwere Folgen hat . Unangemessene oder unnötige Verschreibungen von Antibiotika, der übermäßige Einsatz von Antibiotika in der Agrar- und Viehwirtschaft und die mangelnde Einhaltung vollständiger Antibiotika-Therapien durch die Patienten, die alle resistente Bakterien auswählen, scheinen die Hauptursachen für die Entstehung von Antibiotikaresistenzen zu sein. Resistente Bakterien können sich auch ausbreiten und zu breiteren Infektionskontrollproblemen werden, nicht nur innerhalb von Gesundheitseinrichtungen, sondern auch innerhalb von Gemeinden. Aus diesem Grund besteht ein dringender Bedarf, neue antibakterielle Therapien nicht nur gegen Bcc-Bakterien, sondern auch gegen andere Humanpathogene zu entwickeln . In diesem Zusammenhang stellt die Suche nach neuen natürlichen Wirkstoffen aus “ungewöhnlichen” Quellen einen der wichtigsten Ansätze dar; besonders interessant könnten die ätherischen Öle sein, da sie mehrkomponentig sind und im Prinzip die Wahrscheinlichkeit, dass Bakterien Resistenzen gegen dieses Stoffgemisch entwickeln, viel geringer ist als gegen ein einzelnes Molekül.Ziel dieser Arbeit war es daher, die antimikrobielle Aktivität von sechs verschiedenen ätherischen Ölen im Vergleich zu einer Gruppe von Bcc-Bakterien zu untersuchen, von denen einige eine Multiresistenz gegen verschiedene Medikamente und entweder mit klinischer oder umweltbedingter Quelle aufweisen, um die Möglichkeit der Verwendung ätherischer Öle zur Bekämpfung von Bcc-Infektionen bei CF-Patienten zu überprüfen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Sie wurden entweder auf Trypton-Soja-Agar (TSA, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italien) Medium bei 37°C für zwei Tage oder in flüssiger Trypton-Sojabrühe (TSB, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italien) Medium bei 37°C unter Schütteln.

Burkholderia cepacia complex strains
Strain Origin Species Sensitivity to
Eugenia caryophyllata Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Lavandula hybrida Melaleuca alternifolia Thymus vulgaris Ciprofloxacin
LMG 13010 CF B. multivorans ES ES S S S ES VS
J2315 CF B. cenocepacia ES ES S S S ES S
LMG 14294 CF B. stabilis ES ES S S S ES NS
LMG 24064 CF B. latens ES ES ES S S ES ES
LMG 24065 CF B. diffusa ES ES VS S S ES VS
LMG 18943 CF B. dolosa ES ES VS S VS ES NS
LMG 24067 CF B. seminalis ES ES S S S ES VS
LMG 24068 CF B. metallica ES ES S S S ES ES
LMG 26883 CF B. pseudomultivorans ES ES VS S S ES VS
LMG 23361 AI B. contaminas ES ES VS S S ES ES
LMG 1222 Env B. cepacia VS ES S S S ES VS
LMG 10929 Env B. vietnamiensis ES ES ES S VS ES ES
LMG 19182 Env B. ambifaria ES ES NS S S ES ES
LMG 20980 Env B. anthina ES ES VS S ES ES ES
LMG 14191 Env B. pyrrocinia ES ES VS S ES ES ES
LMG 22485 Env B. lata ES ES S S S ES ES
LMG 24066 Env B. arboris ES ES VS S S ES ES
LMG 20358 Env B. ubonensis ES ES ES S VS ES ES
CF: strain isolated from cystic fibrosis patient; Env: environmental strain; AI: animal infection; NS, S, VS, and ES: nicht empfindlich, empfindlich, sehr empfindlich bzw. extrem empfindlich (nach Ponce et al., 2003) .
Tabelle 1
Liste der in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und ihre Empfindlichkeit gegenüber den in dieser Arbeit getesteten ätherischen Ölen.

2.2. Aromatogramme
2.2.1. Herstellung von mikrobiellen Suspensionen und Medien

Jeder Bakterienstamm wurde bei 37°C in flüssigem Medium (TSB) unter Schütteln gezüchtet; das Wachstum wurde in regelmäßigen Zeitabständen (als spektralphotometrischer Messwert bei OD600) überprüft, bis das Ende der exponentiellen Wachstumsphase erreicht war. Serielle Verdünnungen 1: 10 bis 10-5 jeder Bakteriensuspension wurden auf TSA-Petrischalen plattiert, um die Mikroorganismen zu zählen und zu überprüfen, ob die Anzahl der Bakterien in den Proben der Durchführung der Tests angemessen war.

TSA, das zur Durchführung der Agardiffusionstests verwendet wurde, wurde mit einem geeigneten Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO, Carlo Erba Reagenti S.p.a., Strada Rivoltana km 6/7, 20090 Rodano, MI, Italien), sterilisiert durch Filtration durch Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 µm (Sartorius Italy Srl, Viale A. Casati 4, 20835 Muggiò, MB, Italien), wodurch 0,5% (v / v) Lösungen erhalten werden, die durch die Abkürzungen von DTSA identifiziert werden. Die Zugabe von DMSO, einem aprotischen organischen Lösungsmittel, das zur Kategorie der Sulfoxide gehört, hatte den Zweck, die Löslichkeit ätherischer Öle in dem durch die Kulturmedien dargestellten wässrigen Medium zu erleichtern.

2.2.2. Herstellung von Verdünnungen ätherischer Öle

Die in dieser Studie verwendeten ätherischen Öle (Eugenia caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Lavandula hybrida, Melaleuca alternifolia und Thymus vulgaris) wurden alle durch Wasserdampfdestillation extrahiert und vom selben Einzelhändler (Prodotti Phitocosmetici Dott. Vannucci di Vannucci Daniela e C. Sas, Via la Cartaia Vecchia 3, 59021 Vaiano (PO), Italien). Alle EOs- und EOs-Verdünnungen wurden vor Gebrauch bei 4 ° C gelagert.

2.2.3. Agar Disk Diffusion Assay

Burkholderia Zellsuspensionen wurden auf DTSA Petrischalen gestreift. Sterile Filterpapierscheiben (Oxoid). Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italien) von 6 mm Durchmesser wurden mit jeweils 10 µL nicht verdünntem EO getränkt und auf die Oberfläche des Geschirrs gelegt. Zusätzlich wurden Positiv- und Negativkontrollen auf die Oberfläche von Agarplatten aufgebracht; es handelte sich jeweils um das Antibiotikum Ciprofloxacin (3 µg/10 µL) (Oxoid S.p.A. Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italien) und eine Lösung von DMSO 0,5% in sterilem entionisiertem Wasser. Die Platten wurden 48 h aerob bei °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Durchmesser der Hemmzonen in Millimetern gemessen, einschließlich des Scheibendurchmessers. Die Empfindlichkeit gegenüber der EOs wurde durch den Durchmesser der Hemmzonen wie folgt klassifiziert: nicht empfindlich für Gesamtdurchmesser kleiner als 8 mm, Empfindlich für Gesamtdurchmesser 9-14 mm, sehr empfindlich für Gesamtdurchmesser 15-19 mm und extrem empfindlich für Gesamtdurchmesser größer als 20 mm . Jeder Assay wurde in dreifacher Ausfertigung in drei separaten Versuchsläufen durchgeführt.

2.3. Bestimmung der Zusammensetzung ätherischer Öle

Gascromatographische (GC) Analysen wurden mit einem Gerät der Serie HP-5890 II durchgeführt, das mit einer HP-5-Kapillarsäule (30 µm × 0,25 mm, 0,25 µm Filmdicke) ausgestattet war und mit folgendem Temperaturprogramm arbeitete: 60 ° C für 10 min, Rampe von 5 ° C / min auf 220 ° C; Injektor- und Detektortemperaturen, 250 ° C; Trägergas, Stickstoff (2 ml / min); Detektor, Dual Flame Ionisation Detection (FID) ; split-Verhältnis, 1 : 30; Injektion, 0,5 µl. Die Identifizierung der Komponenten erfolgte für beide Säulen durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit denen reiner authentischer Proben und mittels ihrer linearen Retentionsindizes (LRI) bezogen auf die Reihe der -Kohlenwasserstoffe. Gaschromatographie-Electron Impact Mass Spectrometry (GC-EIMS) Analysen wurden mit einem Varian CP 3800 Gaschromatographen (Varian, Inc. Palo Alto, CA) ausgestattet mit einer DB-5 Kapillarsäule (Agilent Technologies Hewlett-Packard, Waldbronn, Deutschland; 30 m × 0,25 mm, Schichtdicke 0,25 mm) und einem Varian Saturn 2000 Ionenfallen-Massendetektor. Analytische Bedingungen waren wie folgt: Injektor- und Transferleitungstemperatur bei 250 bzw. 240 °C, Ofentemperatur von 60 bis 240 °C bei 3 °C/min programmiert, Trägergas, Helium bei 1 ml/min, Splitless-Injektor. Die Identifizierung der Bestandteile basierte auf dem Vergleich der Retentionszeiten mit denen der authentischen Proben, dem Vergleich ihrer LRI relativ zur Reihe der n-Kohlenwasserstoffe und dem Computerabgleich mit kommerziellen und hausgemachten Bibliotheksmassenspektren, die aus Reinsubstanzen und Komponenten bekannter Proben und MS-Literaturdaten aufgebaut waren . Darüber hinaus wurden die Molekulargewichte aller identifizierten Substanzen durch Gaschromatographie-chemische Ionisationsmassenspektrometrie (GC-CIMS) unter Verwendung von Methanol als chemisches Ionisationsgas bestätigt.

2.4. Statistische Analysen

Inhibitionszonen in Bcc-Stämmen aus den verschiedenen EOs wurden unter Verwendung der Hauptkomponentenanalyse analysiert, wie sie in der VERGANGENHEIT implementiert wurde Software . Der Kruskal-Wallis-Test mit Bonferroni-Fehlerschutz wurde zum Vergleich der Gesamthemmungszonen aus den verschiedenen EOs unter Verwendung der Analyse-it-Software (Analyse-it Software, Ltd.).

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Zusammensetzung von ätherischen Ölen

Ätherische Öle sind sehr komplexe natürliche Mischungen, die etwa 20-60 Komponenten in sehr unterschiedlichen Konzentrationen enthalten können. Sie zeichnen sich durch zwei oder drei Hauptkomponenten in relativ hohen Konzentrationen (20-70%) im Vergleich zu anderen in Spuren vorhandenen Komponenten aus. Terpenoide (hauptsächlich Monoterpenoide und Sesquiterpenoide) stellen im Allgemeinen die Hauptbestandteile dar, aber einige ätherische Öle zeichnen sich durch aromatische (Phenylpropanoide) und aliphatische Bestandteile aus, die alle durch ein niedriges Molekulargewicht gekennzeichnet sind.

Die getesteten ätherischen Öle waren kommerzielle Proben und wurden mittels GC unter Verwendung einer Dual-FID- und Elektronenschlag-Massenspektrometrie als Detektor analysiert. Bestandteile wurden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten beider Säulen mit denen reiner authentischer Proben und mittels ihrer linearen Retentionsindizes (LRI) relativ zu der Reihe von -Kohlenwasserstoffen und MS-Daten aus Massenspektren und Literatur der Bibliothek identifiziert.

Fast 100% der flüchtigen Bestandteile des ätherischen Oreganoöls wurden identifiziert, wobei 77,2% der oxygenierten Monoterpene, hauptsächlich vertreten durch Carvacrol, 71,8% des gesamten ätherischen Öls ausmachten; 19,2% der Bestandteile wurden durch Monoterpenkohlenwasserstoffe, hauptsächlich -Cymol, repräsentiert; 2.9% waren Sesquiterpene Kohlenwasserstoffe, und 0,6% waren mit Sauerstoff angereicherte Sesquiterpene.

Auch bei ätherischem Rosmarinöl betrugen die identifizierten flüchtigen Bestandteile 99,9% und die Hauptbestandteile waren oxygenierte Monoterpene (64,6%), die das flüchtige 1,8-Cineol (43,9%) darstellten. Monoterpenkohlenwasserstoffe waren 25,9%, hauptsächlich α-Pinen. Sesquiterpenkohlenwasserstoffe betrugen 9,1% und sauerstoffhaltige Sesquiterpene nur 0,3%.

Die identifizierten Gesamtbestandteile von Thymianöl betrugen 99,5%. Diese flüchtigen Stoffe waren dadurch gekennzeichnet, dass 53,7% Monoterpenkohlenwasserstoffe 47 waren.9% p-Cymol und oxygenierte Monoterpene 45,6%, hauptsächlich Thymol (43,1%). Nur 0,2% der flüchtigen Stoffe waren Sesquiterpene Kohlenwasserstoffe.

Etwa 98% der Bestandteile von Nelkenöl wurden identifiziert und der Hauptmetabolit war Eugenol (85%), ein typisches Phenylpropanoid, während 11,2% der Bestandteile als Sesquiterpenkohlenwasserstoffe erkannt wurden, wobei β-Caryophyllen das Hauptmolekül war (9%).

Ungefähr alle (99,1%) der Bestandteile von M. alternifolia wurden identifiziert; Hauptverbindungen waren oxygenierte Monoterpene, wobei 4-Terpineol das Hauptbestandteil war (39,9%). Der Rest des Öls bestand hauptsächlich aus Monoterpenkohlenwasserstoffen (41,4%), wobei γ-Terpinen (14,4%) und α-Terpinen (8,8%) die Hauptmoleküle waren.

3.2. Antimikrobielle Aktivität der ätherischen Öle gegen Burkholderia cepacia Complex (Bcc) Stämme

Die antimikrobielle Aktivität der sechs verschiedenen Stämme (E. caryophyllata (Ec), O. vulgare (Ov), R. officinalis (Ro), L. hybrida (Lh), M. alternifolia (Ma) und T. vulgaris (Tv)) wurde an den in Tabelle 1 aufgeführten 18 Bcc-Stämmen überprüft und repräsentativ für die 18 bekannten Bcc-Arten; dieses Panel umfasst Stämme klinischer oder umweltbedingter Herkunft.

Die erhaltenen Daten sind in Abbildung 1 dargestellt und zeigen Folgendes.(i)Alle 18 Bakterienstämme, sowohl klinischer als auch umweltbedingter Herkunft, zeigten, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, eine Empfindlichkeit gegenüber jedem der sechs getesteten Stämme.(ii) Nach Ponce et al. , drei ätherische Öle, das heißt, Ec, Tv und Ov, zeigten eine sehr hohe Hemmkraft gegenüber allen getesteten Bcc-Stämmen. In der Tat waren sie alle äußerst empfindlich gegenüber diesen drei Faktoren.(iii) Interessanterweise ergaben diese drei EOs einen hemmenden Halo, der viel größer war als der von Ciprofloxacin, was darauf hindeutet, dass sie aktiver sind als dieses Antibiotikum.(iv) Die anderen drei EOs (Ro, Lh und Ma) zeigten einen geringeren Grad an Hemmung des Bcc-Wachstums als die drei oben genannten EOs; Die von ihnen erzeugten inhibitorischen Halos waren jedoch ähnlich und in vielen Fällen größer als die von Ciprofloxacin.(v) Offensichtlich zeigten klinische und Umweltstämme keine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber einem bestimmten EO (oder einer Reihe von EOs), aber sie waren unterschiedlich empfindlich gegenüber Ciprofloxacin (Tabelle 1). Zwei von ihnen, das heißt LMG 14294 (B. stabilis) und LMG 18943 (B. dolosa), waren resistent gegen das Antibiotikum und B. cenocepacia J2315, das Modellsystem für die Untersuchung der Bcc-Infektion bei CF-Patienten, zeigte eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Ciprofloxacin. Diese drei Stämme haben einen klinischen Ursprung. Trotzdem waren die gleichen drei Stämme extrem empfindlich gegenüber den drei aktivsten EOs.(vi) Umwelt-Bcc-Stämme waren gegenüber Ciprofloxacin viel empfindlicher als ihre klinischen Gegenstücke.Die differentielle Empfindlichkeit gegenüber EOs und Ciprofloxacin wurde durch eine Hauptkomponentenanalyse bestätigt (Abbildung 2). Wie im Biplot gezeigt, sind die für EOs verantwortlichen Vektoren differentiell orientiert als die von Ciprofloxacin (C +). Darüber hinaus trugen die Vektoren für Ov und Tv stark zum differentiellen Empfindlichkeitsmuster bei, was bestätigte, dass die aktivsten ätherischen Öle T. vulgaris und O. vulgare waren. Schließlich zeigte ein paarweiser Vergleich (Kruskal-Wallis-Test) der Hemmungsmuster von EOs und Ciprofloxacin (Abbildung 2), dass große Unterschiede zwischen inhibitorischen Halos verschiedener EOs und Ciprofloxacin vorliegen, was die beobachteten (Tabelle 1, Abbildung 1) Unterschiede in der Hemmkraft der sechs EOs hervorhebt.

(ein)
(ein)
(ein)
(ein)

(ein)
(ein)(b)
(b)

Abbildung 1

Hemmende Kraft ätherischer Öle. Die Ergebnisse für den Agar-Diffusionstest, der an den Stämmen vom Typ 18 Bcc durchgeführt wurde, werden vorgestellt. Jeder Balken des Histogramms repräsentiert den Mittelwert der Hemmzone, die für jede der analysierten EOs erhalten wurde. In den Grafiken sind die Standardabweichungen für jedes erhaltene arithmetische Mittel angegeben: (1) Thymus vulgaris, (2) Rosmarinus officinalis, (3) Lavandula hybrida, (4) Eugenia caryophyllata, (5) Melaleuca alternifolia, (6) Origanum vulgare, and (7) Ciprofloxacin.

Figure 2

Differences in the patterns of inhibition of essential oils. Upper panel: principal component analysis biplot of inhibitory patterns 18 Bcc strains (centroids) treated with different EOs and ciprofloxacin (C+). The percentage of variance explained by the first two principal components is reported. Untere Tafel: Werte von paarweisen Vergleichen (Kruskal-Wallis-Test und Bonferroni-Fehlerschutz) zwischen EOs und C+. n.s.: nicht signifikant; *; **; ***.

4. Schlussfolgerungen

In dieser Arbeit haben wir eine vorläufige Analyse der Fähigkeit von sechs verschiedenen ätherischen Ölen durchgeführt, das Wachstum von Stämmen des B. cepacia-Komplexes zu hemmen, deren Mitglieder für CF-Patienten gefährlich sind. Diese Idee stützt sich auf frühere Erkenntnisse, die zeigen, dass ätherische Öle das Wachstum einiger menschlicher Krankheitserreger wie E. coli, S. enteritidis, S. choleraesuis und S. typhimurium hemmen können . Über die Fähigkeit dieser Mischungen chemischer Verbindungen, das Wachstum von Bcc-Mitgliedern zu hemmen, ist jedoch nach unserem besten Wissen nichts bekannt.

Aus diesem Grund haben wir sechs verschiedene ätherische Öle (E. caryophyllata, O. vulgare, R. officinalis, L. officinalis, M. alternifolia und T. vulgaris) ausgewählt, die im Vergleich zu einem Panel getestet wurden, in das die Typenstämme der bekannten 18 Bcc-Arten eingebettet waren.

Die Zusammensetzung der sechs Stämme war ziemlich unterschiedlich, aber trotzdem zeigten alle eine hemmende Aktivität gegenüber allen 18 Bcc-Stämmen, was darauf hindeutet, dass eine Verbindung oder (wahrscheinlicher) mehr als eine Verbindung (siehe unten) in jedem ätherischen Öl vorhanden ist könnte das Bcc-Zellwachstum stören. Die sechs ätherischen Öle zeigten jedoch eine unterschiedliche inhibitorische Aktivität und laut Ponce et al. sie könnten in zwei verschiedene Cluster aufgeteilt werden; der erste umfasst T. vulgaris, O. vulgare und E. caryophyllata, während der andere R. officinalis, M. alternifolia und L. officinalis (Tabelle 2). Tatsächlich waren Bcc-Stämme extrem empfindlich gegenüber den EOs der ersten Gruppe und nur empfindlich gegenüber den anderen drei.

Constituents LRI Essential oil
Lavandula hybrida Eugenia caryophyllata Melaleuca alternifolia Origanum vulgare Rosmarinus officinalis Thymus vulgaris
Tricyclene 928 0.2 tr
-Thujene 933 0.6 tr
-Pinene 941 0.4 0.2 3.8 1.7 11.5 4.3
Camphene 955 0.3 tr 0.4 4.1 0.1
Thuja-2.4(10)-diene 959 tr
Sabinene 977 0.1 tr 0.6
-Pinene 982 0.6 0.1 2.1 0.4 3.8 1.2
Myrcene 993 0.5 0.6 1.3 1.3
-Phellandrene 1006 0.4 tr 0.2
1-Hexyl acetate 1010 0.1
-3-Carene 1013 tr tr tr
1.4-Cineole 1018 0.1
-Terpinene 1020 tr 8.8 0.8 0.4
-Cymene 1027 0.3 tr 3.7 11.6 1.9 47.9
Limonene 1032 0.7 0.1 2.0 1.1 1.8 0.2
1.8-Cineole 1034 6.9 tr 2.9 0.6 43.9 0.2
()–Ocimene 1042 0.3
-Terpinene 1063 tr 14.4 1.7 0.4
cis-Sabinene hydrate 1070 0.1 tr tr
cis-Linalool oxide (furanoid) 1077 0.3
Terpinolene 1090 4.4 0.2 0.3
trans-Linalool oxide (furanoid) 1090 0.2
1-Pentyl butyrate 1094 tr
trans-Sabinene hydrate 1099 0.3
Linalool 1101 27.1 1.8 0.9 1.2
1-Octenyl acetate 1112 0.4
exo-Fenchol 1118 tr tr tr
cis-p-Menth-2-en-1-ol 1123 0.4
Terpinen-1-ol 1135 0.2
trans-Pinocarveol 1141 tr
trans-p-Menth-2-en-1-ol 1142 0.4
Camphor 1145 8.4 tr 11.3
1-Hexyl isobutyrate 1152 0.2
Isoborneol 1158 0.2
trans-Pinocamphone 1162 tr
Pinocarvone 1164 tr
Borneol 1168 3.2 0.4 4.2
Lavandulol 1171 0.6
cis-Pinocamphone 1175 tr
4-Terpineol 1178 3.9 tr 39.9 0.2 0.8
-Cymen-8-ol 1185 tr
-Terpineol 1190 1.7 4.2 0.4 2.6 0.6
1-Hexyl butyrate 1193 0.6
cis-Piperitol 1195 tr
Verbenone 1206 0.2
trans-Piperitol 1207 0.2
Nerol 1230 0.2
1-Hexyl 2-methylbutyrate 1235 0.1
1-Hexyl 3-methylbutyrate 1244 0.3
Chavicol 1252 tr
Linalyl acetate 1259 30.4
trans-Ascaridolglycol 1268 0.2
Isobornyl acetate 1287 0.2 0.7
Lavandulyl acetate 1291 3.3
Thymol 1292 1.6 43.1
Carvacrol 1301 71.8 0.4
1-Hexyl tiglate 1333 0.2
-Cubebene 1352 tr tr
Eugenol 1358 85.0
Neryl acetate 1365 0.4
-Ylangene 1373 0.2
-Copaene 1377 0.2 tr tr 0.6
Geranyl acetate 1383 1.0
-Gurjunene 1410 0.5
-Caryophyllene 1419 2.2 9.0 0.5 2.7 5.1 0.2
Lavandulyl isobutyrate 1424 0.1
trans–Bergamotene 1437 0.2 tr
-Guaiene 1440 1.4 0.2
(Z)–Farnesene 1444 0.2
-Humulene 1455 tr 1.4 0.1 0.2 0.5 tr
(E)–Farnesene 1459 1.1
Alloaromadendrene 1461 0.6
-Muurolene 1478 0.6
Germacrene D 1482 0.3
Valencene 1493 0.3
Viridiflorene 1494 1.3 0.2
Bicyclogermacrene 1496 0.7
-Muurolene 1499 0.2 0.2
-Bisabolene 1509 0.2 0.2
Lavandulyl 2-methylbutyrate 1513 0.4
trans–Cadinene 1514 0.5 0.4
-Cadinene 1524 0.6 1.8 0.9
trans-Cadina-1(2).4-diene 1534 0.2
Spathulenol 1577 0.2
Caryophyllene oxide 1582 0.6 0.5 0.6 0.3 tr
Globulol 1584 0.5
Guaiol 1597 0.2
1-epi-Cubenol 1629 0.3
T-Cadinol 1640 0.2
Cubenol 1643 0.2
-Bisabolol 1684 0.4
Monoterpene hydrocarbons 3.2 0.4 41.4 19.2 25.9 53.7
Oxygenated monoterpenes 88.2 0.0 48.7 77.2 64.6 45.6
Sesquiterpene hydrocarbons 4.7 11.2 7.6 2.9 9.1 0.2
Oxygenated sesquiterpenes 1.2 0.5 1.4 0.6 0.3 tr
Phenylpropanoids 85.0
Other derivatives 1.9 tr
Total identified 99.2 97.1 99.1 99.9 99.9 99.5
LRI: lineare Retentionsindizes relativ zur Reihe der -Kohlenwasserstoffe; tr: Spuren.
Tabelle 2
Zusammensetzung (%) und Hauptklassen (%) der sechs in dieser Arbeit verwendeten ätherischen Öle.

Alle sind jedoch in der Lage, das Wachstum von Bcc-Stämmen zu hemmen; besonders interessant und faszinierend ist der Befund, dass die von den meisten EOs produzierten inhibitorischen Halos (viel mehr) größer sind als die von Ciprofloxacin, einem der in der CF-Infektionstherapie verwendeten Antibiotika. Wir sind uns vollkommen bewusst, dass die Empfindlichkeit gegenüber einem bestimmten Arzneimittel oder einer komplexen Mischung antimikrobieller Verbindungen auch zwischen Stämmen derselben Bakterienart stark variieren kann. Unserer Meinung nach sind die in dieser Arbeit berichteten vorläufigen Daten jedoch besonders ermutigend, da sie zeigen, dass die Verwendung ätherischer Öle einen alternativen Weg zur Bekämpfung des Bcc-Wachstums darstellen könnte. Es ist auch sehr interessant, dass trotz der hohen Anzahl von Experimenten, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, keine Bcc-Mutante isoliert wurde, die gegen eines der getesteten ätherischen Öle resistent war (Daten nicht gezeigt). Dies stellt einen sehr wichtigen Befund dar, der stark darauf hindeutet, dass die Fähigkeit ätherischer Öle, das Wachstum von Bcc-Zellen zu hemmen, sehr wahrscheinlich auf das gleichzeitige Vorhandensein verschiedener Moleküle im Öl zurückzuführen ist (deren Wirkmechanismus noch unbekannt ist). Darüber hinaus sollten diese Kombinationen von Verbindungen unserer Meinung nach nicht auf ein einzelnes Ziel wirken, sondern auf verschiedene molekulare Ziele innerhalb der Bcc-Zelle. Wenn dies der Fall ist, sollte die gleichzeitige Blockierung der Aktivität verschiedener molekularer Ziele die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Mutante, die den ätherischen Ölen widerstehen kann, stark verringern. Wenn dieses Szenario korrekt ist, könnten diese Daten den Weg für die Verwendung von ätherischen Ölen zur Bekämpfung von Bcc-Infektionen bei CF-Patienten ebnen.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.

Danksagungen

Marco Fondi und Elena Perrin werden durch ein FEMS Advanced Fellowship (FAF 2012) bzw. ein “Buzzati-Traverso” Foundation Fellowship finanziell unterstützt.

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